左侧管旋转180°凝胶不能保持完整为阴性，记为“－”；右侧管旋转 180°凝胶不变形为阳性，记为“＋”。
举例： 设待复核的鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml:
平行 管数
内毒素标准溶液浓度（EU/ml）
1 2 3 4
0.25 + + + +
0.125 0.06 + + + + + -
0.03 -
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
方法学验证—供试品干扰预试验
（1）原则上一般根据药品使用说明书或国家药典委
员会编制的《临床用药须知》来确定最大剂量。 如 儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为 准。 （2）为保证安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗 心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品药 品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2 或1/3。

近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源 法
在药检中的应用
细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，
已经广泛的被世界各国药典收载。

成品检查——药品安全性检查之一 半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避 免造成药品成批报废

二、细菌内毒素检测方法
《中国药典》批准使用方法： 测定 方法
凝胶法
光度测定法
浊度法 显色基质法

供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测 定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。
鲎试剂与内毒素反应机理
内毒素 C因子 活化的C因子
B因子
凝固酶原
活化的B因子
凝固酶 凝固蛋白原 鲎凝血系统－酶联反应 凝胶

供试品溶液的最大稀释倍数的计算 MVD＝CL/λ L:供试品的内毒素限值；
C：供试品溶液的浓度；
当L以 EU/ml表示时，C为1ml/ml;当L以EU/mg或 EU/u表示时，C的单位为mg/ml或u/ml(注意：当L以 EU/ml表示时，C的值不是样品的浓度，就是1)。
方法学验证—供试品干扰预试验
(1).供试品稀释法 MVD=CL /λ 鲎试剂灵敏度(λ )越高(数值越小)，供试品的稀 释倍数越大，干扰越小。
(2).物理方法 如加热法(血液制品)、冷析法(甘露醇 ) (3).化学方法 如调节PH值(奎诺酮类)、调节金属离子(血液保 养液、FDP) (4).生物方法 如抗增液的使用，阻断G因子反应，防止假阳性； (5).其它方法 如过滤法、溶剂抽提等
6、鲎试剂浓度达不到要求 开启内毒素标准品和鲎试剂时，要将粘附在安 瓿壁上的粉末尽可能地弹落下去。用砂轮划过 安瓿后，要用酒精棉（最好能用沾异丙醇的无 纺布，以避免产生假阳性结果）擦拭，防止开 启时玻璃屑落入安瓿内。开启内毒素标准品时， 要在安瓿曲颈上部，并尽可能保留较长的安瓿 颈，准确加入1.0ml鲎试验用水复溶。
NC
/ /
X 反应终 点浓度C (lgC)
0.06 -1.22 0.125 -0.903 0.125 -0.903 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λ c在0. 5λ ～2.0λ 范围内，符合规定。
2λ 2λ 2λ 2λ
λ λ λ λ
0.5λ 0.5λ 0.5λ 0.5λ
0.25λ 0.25λ 0.25λ 0.25λ
1 2λ
2 λ
3 0.5λ
4 0.25λ
BET水

反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动 混匀，置37 ℃水浴中保温60±2min，将每管拿出缓 缓倒转180°，凝胶不变形为“＋”，凝胶不能保持 完整为“－”。 当2.0λ四支管都为阳性，0.25λ四支管都为阴性时， 试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度λc ： λ c＝lg-1(∑X/4) （X:反应终点浓度的对数值。） 当0. 5λ≤λ c ≤2.0λ时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测 时仍以标示灵敏度λ为准。

内毒素限值(L)的确定 药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采 用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中K为 按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以接受的 不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热 阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途 径的K值都有具体的规定。M为按规定的给药途径， 人每公斤体重每小时给药的最大剂量。这一个值的 确定实际上才是计算限值的关键。
故：灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水
光度法：
内毒素含量应小于0.005EU/ml；
细菌内毒素检测之凝胶法
实验程序
1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测
实验材料及用具 1、仪器 名称
3、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。 4、温度不符合要求 实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为 37±1℃为宜。 5、忽视样品本身干扰
供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要 原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。
浅析细菌内毒素检测方法及常见 问题
内
细菌内毒素简介
容
细菌内毒素检测方法 常见问题及解决方案
一、细 菌 内 毒 素 简 介
主要内容
—— 来源 —— 特性
—— 与热源的关系
—— 在药检中应用
主要来源
主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自 溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖， 这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约 在1~ 5纳米 。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。 将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
与热源对比内毒素检查法优势
方便、快捷、经济； 重现性好、灵敏度高； 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
名词解释1—鲎及鲎试剂
鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一 带。 鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机 械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物， 能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应 的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体 外检测内毒素的敏感试剂。

灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度 复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平 条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。 试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支； 待测鲎试剂灵敏度λ ＝0.25EU/ml。 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉 末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开， 加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min 后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)：
5.吸附性
能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有 一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。
热原=内毒素
？
热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物 等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。 但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热 原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒 素就是控制热原。
热原检查方法简介
—其他适宜的方法
如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。

供试品细菌内毒素凝胶法检测
检测方法： 编号 A B C 内毒素浓度/配制内毒素的 平行管数 结果 溶液 判定 无/供试品溶液 2 阴性 2λ /供试品溶液 2λ /检查用水 2 2
阳性
阳性 阴性
D
无/检查用水
2
注：A 无干扰浓度供试品溶液；B 供试品阳性对照；C 阳性对照；D 阴性对照。
C
2λ /检查用水
检查用水
D
无/检查用水
—
方法学验证—供试品干扰试验
结果判定：
如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度（λc） 均在0.5λ-2.0λ范围内时，则认为供试品在该浓度下不干 扰试验，否则需要对供试品做适当处理。
干扰的排除：
—对供试品进行更大倍数的稀释； —选择灵敏度更高的鲎试剂；

天平 电热干燥箱 恒温水浴箱 水银或酒精温度计 漩涡混合器 计时器
要求 感量0.1mg以下 ～300℃ 37±1 ℃ ～100 ℃±1 ℃ / 60min±1min
2、器具
器具分类
器具名称
反应试管 玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、 小三角瓶或磨口瓶
移液器具 刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头 其他
名词解释2—国家标准品及工作标准品
国家标准品： （单位：EU/ml）
自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、 仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的 效价；
工作标准品：
经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符 复核、干扰试验及各种阳性对照；
名词解释3—细菌内毒素检查用水
凝胶法：
内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；