-C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定广东学药学院报ournJa lfoGuang dngo ParmhceutiaalcUn ievrstyiunJ 2．14， 030（3）C 7 5胚小胎神经鼠干胞的分离、培细与养定鉴 12 万丽 1 易，林，桦贝伟剑（1 广．药学院东中医药研究 / 广东省院代性谢病疾中医防治药重实点室验，家国中医药理局管脂高血调肝降脂症重研点究室/ 国家中药管理医局代谢脂级实三室验，东广广 5州10006 ；．2中大学山生科命学院干学胞研究细室，广广州东510 006）培养神经干胞细（NSCs ）并，对其行进鉴定方。
采法用动手法胰蛋白酶消化及法摘：要的体外分目离分离、鼠脑细胞胎，用化的无优血清NS C 培s养基行进养培。
细胞疫免光荧检法测N CSs特异性标记子 3 d分左获右得大未分量化巢呈悬浮状生的长表的达结。
果分离脑的细体胞培外养48 h已部分大壁贴神，经干胞细团第 3 代时，。
少很见到贴细壁胞，几乎是神全球，经神经球周围在存较多刺微。
细表胞达一中种间丝蛋白，即巢蛋白（nes ti）n 。
论结成功分、离鉴定出C57小鼠 NSsC，并在体外可件条进下行传扩增培代养。
关键词：C 57 胎小胚；鼠经干细胞；神胞细培；养蛋巢白中分图类：号Ｒ392 文献志标码 A：d i： 10．o396 9j/．sin．1s060873．8214003．0．22878 （3 214）0 00354340 章文编号：0016-Islaoion，t culurtean d iedtifnciaitnoo f eunalrste mcel sl rfmoC5 e7bmyorin mccieWN Ai1L， IYHual n2 ，iBEI W iejia1n 1．（uGnagdogn TMCKey L abratory ofroM taboelc iisDaees，s Ky eLbarotorayo Modfluaintg Lievrt oTrat HepeyripemlaiS ATM， anC Ldeev 3l Labraotroyo f Liid Mpteboaism SAlTM，CIn stiute oftChinese edMciinla Sicneec，GsuagnongdPha racemtucail UinvesrtyiGuan，gzohu5 1006，0hCin；a 2．St m eCle Ｒlseeacrh Depratmne，t choSlo o fifL Sceeicens， uS nYtasn Ueinersivyt， Guagnzhou， 50006，1China） bsArtatc：Obejtivc Toei slotae cu，turl aned deitnfiy hte eunarlste m cllse（ SCN ）s． Meth od NSsCs for mftal eimce ewe irsloteda bydi sesticon ad nnzeyatmi dcgiestoin a，n ductlrude ni he opttima slreufreem SCN mdeimu． he Tpesifcicb ioamker orfSNC wssa deteted by cmiumnocyotluoresfect assan．y esuＲlst hTe islatedo NSsC dahree dt oth ceutlru elpta ewihit n48 ，and hnstelik clesuetr ofsN CS weresobta iednin th eulcturesus pnseoinin abo u t 3．dOn te 3hth asspgea sf NoSC， asherend cetlsla re arelyrseen， a nd nealryal l erwene rusohperesw th spiinlu． eNsten wasi exprssee idnt ehc ulutrdceels． ClncoulisnoN CS sar secucesfuslyl silaoted an dcutlreu dfomr fetl Ca75mi ec ，adnc olud polifrertae nivitro ． eyKwo rsd C：57 mbeyoricn mci；e nerul stea cemll；s cel cluturel；nest inNCSs）具分有化为经干细胞神（ne uarstemlcle，l神经元、星形质胶细胞少和胶突质细的能胞，力能自。
更我新，并足提以供量大脑组细胞织细的群，，胞SCsN现发已现多种型类的中神经系枢损统后伤激活并被利于有组的损织伤修和功能复复恢。
因400 收2日稿：期2 01［421］此，研究NS Cs 的物学生于对神经统损系修复伤和34［］。
临床用中应，退行病变的性疗治具重有意义要NSsC的来源数量和限是有前存目在的主要题问。
N Ss C体的培养外和增对扩实于其现在潜价值此，［因65 ］。
SCs N的体获外取可过直接通具有从重要用作金项目：基广东省育部产学教研结项目（合202109B1011039 ）；州广科技市计助划项目资（1 1C21307338）3359607，2Em al： 107i515171@9qq ．c m； o通信作要从事中主药药理究研电，： 02话0作简介：者万丽 198（8—），女，士研硕究生，maiE：l biwje200@ a0iyun．lco。
m者贝伟：剑（1 69—） 3，研究，主员要事中从药理研究和新药研发，药男博，士，051 9：6 55 络网版出间：时2 140网出版络地址 ht：pt / ： www．/nkcine．t/ cmk / details 4/．4141．3Ｒ20．4051160．55．091．htm0l3期第等．C57胚胎鼠小神经干细的分离、培胞养鉴与定丽，万355神经组分织离培、养他来其源细干的胞诱分导、永化主要过悬通浮长生贴和生的化SNCs3 种径实途，现壁培养2种方式进行体外扩增。
悬浮神经球（n uersphero aessya，SN A）是 N CS 体外s培养最中常用的方，式该基于 N法SsC 在外无体血清培养中基可依有丝赖裂原分的系维、悬浮成球生长、维自持我［7］更新和分未化态的状特发点建立展来起。
尽管神球经法对相简易单，行不同验室提实出各自的操开腹腔，露两侧暴子，宫用科眼镊住钳宫头子端，顺宫分离至子宫角子剪下处，放入有冰 PS B溶液培养皿，中依次去子宫壁除和膜，胎细仔分离得到组脑织，手动得法到胎鼠脑细。
胞冰 D的MM /EF12 洗涤1遍，加入0．1% （ 0 φ）的胰蛋酶白，在恒培温摇床养MDEM/ F21 终消化。
用止 010上37 ℃消化 30 min， 1 00 0 r /mni 目筛子，过滤收，集于心离中，管离心3 imn，去上，清加入已配制的好NCS 培养基s（含NCsS 2B27、 %0 2gn/ L EGF、 20m g n /m 基 L 础培养、基FGFb）制成单胞悬细液细，计数胞后，之加入6孔板。
3 1。
中原培代养每换天次 1液．．22C 5 胚7 胎小鼠NSCs 的培养和纯化相差显在镜微每下观察天鼠小 SCsN 的贴壁悬及、浮生长作程序但，NSCs 培养对件条和作技术操求要高，不同发育较段脑组织阶的择、细选胞分消化和接种离代方传式、培基成分等细节的养变都会影改 NS响C 的s培养果，结因而如何得获稳、体定增外能力殖和低度成球密力强、能能反复传代的 N够Cs 是NSCsS研［8 究］的基本问题本研究。
从定特育阶发脑段织获取细胞组通过分，离培方养的不法优化断，立从建2．5 1d C57 的孕胚胎鼠脑分中离养培NSCs 方的法。
情和况形变化。
态待细生胞密度达长＞ XX%到长满时，贴壁对分部和浮部分分悬用别0．12 % 5的蛋胰白消化 3 酶inm，开分培，养至第代 3 P3（，）可以到较纯且活得较性好的神干细经胞球。
1．．2 13．．321． 5C 胚7胎鼠的小 SNs 的鉴定C光观察镜倒置微镜显下察不观同间点时神经细胞和干经神球的形态。
11．1料与材方法材料试剂．11．1NSCs 基培础养（基山中学生大科干院细胞中心张雁教授惠赠）； B27（ Gi co 公b司）； FbF （ GroSPecpaTnyT echoGenn eLt．公d司）； EF （ GPrSopecTna yTehcnoeGenLtd．公司）；胰蛋白酶、1．2．32N．CS s 志标蛋 n白sten 表达i 的检测将P 神3经转移至用球 L聚多氨酸包被赖盖的片玻，养培DME/M 1F（2 Hylcoen公司）； PB S、 4% L多赖聚酸、氨（）φ的聚多甲、醛 riTonX100 t （国鼎物技术生有限公司）；山羊清血博奥森（生技物术限有公）司；兔抗巢蛋（ n白etsn）i克多抗隆（体美国 S nata ruzC公）司；抗羊兔 Dy lgith94 （5 aErthx o）； Hocehs33t58、 2片液（封Be yotime公）司。
1．1． 2主仪要器高速冷冻离心机（德国Ep pndore ）f ；水式套CO2 养培（美箱国Shel La 公司 b）；荧倒光置微镜（显国德eZsi s司公）倒；相置差显镜微日（本O ylmusp公司；）B T224S 分天析平［赛多利斯 Sa（troiru）s 科学仪（器北京）有限司公］； P UEＲLAB PUＲLAEBU LTAＲG EM K 超2 Option纯7S 纯机水、5 全0自高压动消毒水锅机 ELGA ）（； HV E H（rayiaam）； CB499WDX冰箱（Haer ）i ；HT10Z3B 恒培养摇温床（上一恒科学海仪有限器公司）。
．1．2 1实动物验C5 7B /L 6小鼠， 18 0，d雌，性自购中山学大实验动中心，生物产可许证号SC KX（粤 201）10029 。
．2 1法方1．2． C157 胎小鼠胚 SNC 的s离分孕将 21． 5 d的 57C 鼠断颈处孕，用死酒精消毒后，之腹沿正中线［9打］至胞大细分部贴壁。
去弃胞培细液，养用 PBS 洗 3 。
遍加4%多聚甲醛定固3 m0in ，加PBS 冲洗 5 mi n× 3 ；0． 2%T irtxo10 0室温膜破1 0inm，P S 洗 B涤5 mi n 3；×5 %的羊山血室温封清闭03mi n P，SB 涤洗 5 mn × 3；i 一抗 nestn i 1 （5∶0 ）4 ℃孵育过夜、抗二 yDLiht g945A ffiniPur Goat enAtiＲabbit gIG （ +HL ）（∶11 00）室温避光孵l h，育oeHcsh33t52 （ 18μg m/）L室温避光复核染15 m ni，P SB冲洗 2 遍，封片，显微镜察观。