响应面法优化白地霉发酵麻疯树饼粕产蛋白质饲料工艺条..
周剑丽胡建锋陈秀勇牛晓娟邱树毅
麻疯树为大戟科麻疯树属植物，是一种抗旱耐脊的速生树种，在我国集中分布在云贵高原南部的干旱地区．随着利用麻疯树果生产生物柴油的扩大化和规模化．其榨油后的饼粕生产量也逐渐增大。

开展对麻疯树饼粕的资源化利用研究，采用微生物发酵麻疯树饼粕生产蛋白质饲料对于弥补我国蛋白质饲料短缺具有重要意义。

本文通过测定培养基中氨态氮的含量(am-moniacal nitrogen content，ANC)作为考察麻疯树饼粕发酵产蛋白质饲料工艺指标。

在考察温度、时间、pH、接种量、初始加水量及发酵过程中翻曲不翻曲这6个因素对培养基中氨态氮含量的影响后．利用Minitab软件设计Plackett-Burman筛选试验筛选出显著性影响因素。

通过最陡爬坡逼近氨态氮产量最大响应区后，利用响应面中心组合设计对显著性影响因素进行优化。

1材料与方法
1．1 试验材料麻疯树饼粕。

贵州省兴义康达生物能源科技有限公司提供，粉碎，过40目筛。

菌株，白地霉(Geotrichum candidum)，CICC31256，中国工业微生物菌种保藏中心。

1．2培养基PDA斜面培养基；PDA液体培养基。

1．3仪器万能粉碎机、生化培养箱、pHS-3C精密酸度计、烘箱、无菌操作台、722s 分光光度计、水浴恒温振荡器、灭菌锅。

1．4试验方法
1．4．1菌悬液的制备在无菌操作台中用无菌水将菌种洗脱到PDA液体培养基中，30℃，l50 r／min，培养48 h。

1．4．2麻疯树饼粕固体培养基的制备粉碎麻疯树饼粕．过40目筛，称取一定量麻疯树饼粕粉，加水调制。

0．1 MPa，121．6℃，灭菌20 min。

1．4．3氨态氮的测定甲醛法(王福荣，2006)。

1．4．4可溶性蛋白质的测定考马斯亮蓝染色法(王福荣．2006)。

1．5发酵条件优化用Minitabl5软件设计6因素2水平的Plackett-Burman(PB)筛选试验设计，再用中心组合试验设计(central composite design，CCD)和响应曲面(response surfaee methodology，RSM)分析模块对重要因素的水平进行优化。

2结果与分析
2．1单因子试验
2．1．1 最适培养时间分别选择发酵周期为1、2、3、4、5、6 d，30℃下培养，发酵结束后测氨态氮和可溶性蛋白质含量，结果见图l。

由图1可知，第1～3天培养基中氨态氮和可溶性蛋白质产量增长最快．第4天培养基中氨态氮和可溶性蛋白质含量均达最大值．4 d后氨态氮和可溶性蛋白质含量趋于平稳．故选择4 d为最适培养时间。

2．1．2最适培养温度分别选择26、28、30、32、34℃作为培养温度，发酵4 d，测培养基中氨态氮含量，见图2。

由图2可知，30℃下，培养基中氨态氮含量较其他组高。

故选择30℃为最适培养温度。

2．1．3最适pH值麻疯树饼粕培养基初始自然pH值为5．8，分别调配初始pH值为5．4、6．2以及自然pH值的培养基，每天取样测培养基中氨态氮含量，结果见图3。

由图3可知，自然pH条件下．氨态氮产量在第3天达到最大值：pH为5．4和6．2条件下，氨态氮产量在第5天达到最大值。

虽然pH值为5．4条件下．氨态氮最高
产量较自然pH条件下略高，但综合考虑实际操作的便捷性及发酵周期，选择自然
pH值为最适pH值。

2．1．4最适初始料水比调制初始加水量分别为50％、70％、90％、ll0％、l30％的培养基，发酵结束取样测培养基中氨态氮含量，结果见图4。

初始加水量为90％和ll0％时．培养基中氨态氮含量均较高。

两者相差不明显，其中初始加水量为90％时，培养基中氨态氮含量最高(为76．62 mg/g),故选择90％为最适初始加水量。

2．1．5 翻曲不翻曲对比翻曲和不翻曲对发酵过程中氨态氮含量的影响．一组试验不翻曲。

对照组每24 h翻曲l次．发酵4 d后测培养基中氨态氮含量，结果见图5。

任何初始加水量的试验组，翻曲较不翻曲培养基中氨态氮含量高，翻曲有利于菌
和培养基的充分接触，增加培养基中的溶氧量．故选择在发酵过程中翻曲。

2．1．6最适接种量分别选择30％、40％、50％、60％、70％(v／m)的接种量，发酵4 d后测培养基中氨态氮和可溶性蛋白质含量，结果见图6。

接种量为50％，氨态氮和可溶性蛋白质含量较其他组高，故选择50％(v／m)为最佳接种量。

2．2 Plackett-Berman设计筛选影响氨态氮产量的显著性因素影响氨态氮产量的因素有培养温度、时间、pH值、接种量、翻曲不翻曲等。

为对这5个因素进行全面考察，选用n=12的Plaekett-Bur-man设计，并设1个空白项作为误差分析项(刘建忠等，2002)。

每个因素取高(+1)低(-1)两个水平。

运用Minitabl5软件分别计算个因素的效应，并对个因素效应进行t检验，选择置信度大于95％的因素作为显著因素进一步考察。

Plackett-Burman设计及试验测得的氨态氮结果见表l。

各因素的系数估计和效应评价见表2。

由表2可知，对白地霉发酵纯麻疯树饼粕产氨态氮有显著影响(置信度大于95％，P<0．05)的因素有温度、初始加水量及翻曲不翻曲，其中，翻曲不翻曲和初始加水量2个因素极显著(P<0．01)．且3个因素对产氨态氮呈现出正效应(代文亮等，2007)。

2．3 最陡爬坡(Steepest ascent)试验确定响应面试验因素水平的中心点响应面拟合方程只有在考察的临近区域里才能较好地反映真实情形，所以．应先逼近最大氨态氮产量区域后再建立有效的拟合方程。

根据Plackett-Burman设计筛选出的显著因素及效应设定其步长，以试验变化的梯度方向为爬坡方向，进行最陡爬坡试验设
计，能最快、经济地逼近最大氨态氮产量区(Li等，2007)。

由Plaekett-Burman试验结果表明，3个显著性影响因子均呈正效应，应增加(熊智强等，2006)。

由于翻曲不翻曲因素属于定性因素，因而不在中心组合设计中考虑该因素。

因为该因素对产氨态氮起较大的正效应，因而选择整个发酵过程中翻曲。

温度和初始加水量的步长依次取+1、+5。

最陡爬坡试验设计及结果见表3。

最大氨态氮产量区在第3次试验附近，故以试验3的条件为响应面试验因素水平的中心点，响应面试验因素水平见表3。

响应面设计的因素水平设置见表4。

2．4 响应面(central composite design)设计确定显著因素的最优水平逼近最大氨态氮产量区后，进行响应面中心组合试验设计，以试验结果拟合建立描述响应量(氨态氮产量)与自变量(影响氨态氮产量的显著性因素)关系的多项式回归模型，运用Minitabl5软件程序对试验数据进行回归拟合．并对拟合方程做显著性检验及方差分析。

再对拟合方程进行规范形分析，寻找回归模型的稳定点．得到最大氨态氮产量时显著因素的最优水平。

2因素5水平的响应面中心组合试验设计及试验测
得的氨态氮含量结果见表5。

2．4．1 回归模型的建立及置信度分析由Minitabl5软件拟合得多项式回归模型为：Y=86．52—3．03A—1．52B+2．59AB一7．46A 2-3．68B2。

回归方程系数的估计见表6，方差分析见表7。

由表6和表7可知，回归方程的一次项、二次项系数和均方差较大．交互项的系数和均方差较小．说明两个因素之间交互效应较小。

在α=0．0001水平上．该模型失拟不显著，回归高度显著。

决定系数(R2)=98．63％，表明98．63％的氨态氮产量变化可由此模型解释，与实际情况拟合很好。

该方程为白地霉发酵麻疯树饼粕产蛋白质饲料提供了一个合适的模型，因此可用上述模型代替真实试验点对白地霉发酵麻疯树的饼粕产蛋白质饲料进行分析和预测。

温度和初始加水量影响氨态氮产量的响应图和等高线图见图7。

2．4．2显著因素水平的优化运用Minitabl5对回归模型进行规范性分析．寻求最大氨态氮产量的稳定点及对应的因素水平．结合图7给出的回归方程的三维响应面图和等高线图可知，回归模型存在稳定点(0.0，0．01030)，对应的A、B实际取值为(30，100)，Y的最大估计值为86．5。

即当温度为30℃，初始加水量为l00％时，该模型的预测的最高氨态氮产量为86．5 mg／g，而实际发酵氨态氮产量为85．6 mg ／g，进一步说明该模型能够较好地预测实际发酵情况。

3 结论
优化后的白地霉发酵麻疯树饼粕产氨态氮的最佳工艺条件为：发酵周期为4 d，自然初始pH值，30℃，接种量为50％(v／m)，每24 h翻曲l次，初始加水量为l00％。

摘自《中国饲料》.-2009，（5）.-37~44。