实验2 水中大肠菌群数的测定一、目的要求1．了解大肠菌群数量在引用水中的重要性2．学习掌握多管发酵法和滤膜法测定大肠菌群数二、原理若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异，因此数量较少，要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时，这样就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。
若指示菌在水中不存在或数量很少，则大多数情况也保证没有病原菌。
最广泛应用的指示菌是大肠菌群，它的定义是：一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，并在乳糖培养基中，经37ºC、24～48h培养能产酸产气，根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。
我国规定每升自来水中大肠菌群不得检出；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得超过10000个。
检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。
多管发酵法使用历史较久，又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性好，又能测定大体积的水样，目前国内已有很多大城市的水厂采用此法。
三、实验仪器和材料1．锥形瓶（500 ml）、试管（18 mm×180 mm）、大试管（容积150 ml）、移液管1 ml 及10ml、培养皿（直径90 mm）、接种环、试管架1个。
2．革兰氏染色液一套：草酸铵结晶紫、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液3．显微镜4．自来水（或受粪便污染的河、湖水）400ml5．蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸钠、牛肉膏、氯化钠、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液、5％碱性品红乙醇溶液、2％伊红水溶液、0.5％美蓝水溶液。
6．10％NaOH、10％HCl、精密pH试纸6.4～8.4。
四、实验前准备工作（一）配培养基1．乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵法的复发酵用）配方：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1 ml、蒸馏水1 000ml、pH＝7.2～7.4。
制备：按配方分别称取蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1 000 ml蒸馏水，调整pH为7.2～7.4。
加入1．6％溴甲酚紫乙醇溶液1 ml，充分混匀后分装于试管内，每管10 ml，另取一小倒管装满培养基倒放入试管内。
塞好棉塞、包扎。
置于高压灭菌锅内以0.7kg/cm2（115℃）灭菌20min，取出置于阴冷处备用。
2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（供多管法初发酵用）按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于试管中，每管5ml。
再分装大试管，每管装50ml，然后在每管内倒放装满培养基的小导管、塞棉塞、包扎，置高压灭菌锅内以0.7kg/cm2（115℃）灭菌20min，取出置于阴冷处备用。
3．品红亚硫酸钠培养基（即远滕氏培养基），供多管发酵法的平板划线用配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾3.5g、琼脂20～30g、蒸馏水1000ml、无水亚硫酸钠5g左右、5％碱性品红乙醇溶液。
制备：先将琼脂加入900ml蒸馏水中加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，加蒸馏水补足至l 000 ml，调整pH为7.2～7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于锥形瓶内，置高压灭菌锅内以0.7 kg/cm2灭菌20min，取出置于阴冷处备用。
现市场上有售配制好的乳糖发酵培养基，使用方便。
4．伊红美蓝培养基配方：蛋白胨10g、乳糖10 g、磷酸氢二钾2 g、琼脂20～30 g、蒸溜水1000ml、2％伊红水溶液10 m1、0.5％美蓝水溶液13 ml制备：按品红亚硫酸钠的制备过程制备。
现市场上有售配制好的伊红美蓝培养基，使用方便。
五、实验方法与步骤（一）大肠菌群的测定1．多管发酵MPN法（按三个步骤进行）多管发酵法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度高的水中的大肠菌群测定。
（1）生活饮用水的测定步骤①初步发酵试验在2支各装有50 ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大发酵管中，以无菌操作各加入100ml水样。
在10支各装有5 ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，以无菌操作各加入10ml水样．混匀后冒于37ºC恒温箱中培养24h，观察其产酸产气的情况。
情况分析：a．若培养基红色不变为黄色，小导管没有气体，即不产酸不产气，为阴性反应，表明无大肠菌群存在。
b．若培养基由红色变为黄色，小导管有气体产生，即产酸又产气，为阳性反应，说明有大肠菌群存在。
c．培养基由红色变为黄色说明产酸，但不产气，仍为阳性反应，表明有大肠菌群存在。
结果为阳性者，说明水可能被粪便污染，需进一步检验。
d．若小倒管有气体，培养基红色不变，也不浑浊，是操作技术上有问题，应重作检验。
②确定性试验用平板划线分离，将经培养24 h后产酸（培养基呈黄色）、产气或只产酸不产气的发酵管取出，以无菌操作，用接种环挑取一环发酵液于品红亚硫酸钠培养基（或伊红美蓝培养基）平板上划线分离，共三个平板。
置于37℃恒温箱内培养18～24 h，观察菌落特征。
如果平板上长有如下特征的菌落并经涂片和进行革兰氏染色，结果为革兰氏阴性的无芽孢杆菌，则表明有大肠菌群存在。
在品红亚硫酸钠培养基平板上的菌落特征：a．紫红色，具有金属光泽的菌落；b．深红色，不带或略带金属光泽的菌落；c．淡红色，中心色较深的菌落。
在伊红、美蓝培养基平板上的菌落特征：a．深紫黑色，具有金属光泽的菌落；b．紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；c. 淡紫红色，中心色较深的菌落。
③复发酵试验以无菌操作，用接种环在具有上述菌落特征、革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌的菌落上挑取一环于装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨培养基的发酵管内，每管可接种同一平板上（即同一初发酵管）的1～3个典型菌落的细菌。
盖上棉塞置于37ºC恒温箱内培养24h，有产酸、产气者证实有大肠菌群存在。
根据证实有大肠菌群存在的阳性菌（瓶）数查表。
报告每升水样中大肠菌群数。
（2）水源水中大肠菌群的测定步骤（一）①稀释水样根据水源水的清洁程度确定水样的稀释倍数，除严重污染外，一般稀释倍数为10-1及10-2，稀释方法如实验七中所述的10倍稀释法（均需无菌操作）。
②初步发酵试验以无菌操作，用无菌移液管吸取1ml 10-2、10-1的稀释水样及l ml原水样，分别注入装有10 ml普通浓度乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，另取10ml原水样注入装有5 ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的发酵管中（注：如果为较清洁的水样，可再取100ml 水样注入装有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养基发酵瓶中）。
置37ºC恒温箱中培养24h后观察结果。
以后的测定步骤与生活饮用水的测定方法相同。
根据证实有大肠菌群存在的阳性管数或瓶数查表，报告每升水样中的大肠菌群数。
（3）水源水中大肠菌群的测定步骤（二）①稀释水样将水样作10倍稀释。
②于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中，各加10ml水样。
于装有10 ml乳糖蛋白胨培养液的5个试管中，各加l ml水样。
于装有10ml乳糖蛋白胨培养液的5个试管中，各加1 ml 10-1的稀释水样。
三个稀释度，共计15管。
将各管充分混匀，置于37ºC 恒温箱中培养24h。
③平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。
④根据证实大肠菌群存在的阳性管数查表，即可求得每100ml水样中存在的大肠菌群数。
乘以10即为1L水中的大肠菌群数。
2．滤膜法适用范围：适用于测定饮用水和低浊度的水源水（1）原理：滤膜是一种微孔薄膜，孔径0.45～0.65微米，能滤过大量水样并将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，算出每L水样中含有的大肠菌群数。
（2）仪器与材料：除与多管发酵法的相同外，另还有：过滤器、抽滤设备、无菌镊子、滤膜（直径3.5 cm和4.7 cm）。
（3）培养基：品红亚硫酸钠培养基（乙）配方：蛋白胨10g、酵母浸膏5g、牛肉膏5g、乳糖10g、磷酸氢二钾3.5g、琼脂15～20g、无水亚硫酸钠5g左右、5％碱性品红乙醇溶液20ml、蒸馏水1 000ml，pH＝7.2～7.4。
乳糖蛋白胨培养液（与多管发酵法相同）。
乳糖蛋白胨半固体培养基：配方：蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母浸膏5g、乳糖10g、琼脂5g、蒸馏水l 000ml，pH ＝7.2～7.4。
（4）操作步骤：首先要作好准备工作，而后才是过滤水样。
准备工作主要是滤膜和滤器的灭菌。
滤膜灭茵时，将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min，前两次煮沸后需更换蒸馏水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。
滤器灭菌使用高压灭菌锅在121ºC下，灭菌20min。
过滤水样时，用无菌镊子夹住滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴在滤器上，稳妥地固定好滤器，将333ml水样（如果水样中含菌量多，可减少过滤水样）注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在-500Pa下抽滤。
水样滤毕，再抽气5s，关上滤器阀门，取下滤器，用镊子夹住滤膜边缘移放在品红亚硫酸钠培养基平板上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37ºC恒温箱内培养22～24h后观察结果。
挑取具有大肠菌群菌落特征的菌落（菌落特征见上述多管发酵法）进行涂片、革兰氏染色、镜检。
将具有大肠菌群菌落特征、革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌接种到乳糖蛋白胨培养液或乳糖蛋白胨半固体培养基。
经37℃培养，前者于24h产酸产气者；或后者经6～8h培养后产气者，则判定为大肠菌群阳性。
计算每L水样中大肠菌群数，即将平板上长出的大肠菌落总数乘以3。
六实验报告1 记录结果，根据你的结果判断所取水样是否符合标准。
2 测定大肠菌群数有何实际意义？为什么选用大肠菌群作为水的卫生指标？。