植物组织培养的基本步骤
1.材料的采集 2.材料的消毒 3.制备外植体 4.接种和培养 5.根的诱导
6.组培苗的
练苗移植
愈伤组织(callus)
在人工培养基上由外植体上形成的一团 无序生长状态的薄壁细胞。
外植体（Explants）
由活植物体上切取下来的可以用于组织 培养的组织或器官
初代培养（Primary culture）
两个主要的哺乳动物细胞表达系统


瞬时表达系统
稳定表达系统
瞬时基因表达系统是一个简单、有效的 外源蛋白表达手段，其表达水平最高可 以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由 未整合的、不复制的质粒DNA产生的， 这样使得蛋白质表达的时间相对短，只 有48h到7天。
稳定表达系统需要得到稳定转化的细 胞株，需要1～2个月的时间，在稳定 转化的细胞中，DNA被整合到染色体 中，这使得重组蛋白质产物可以一代 接一代地产生。
植物组织与细胞培养
植物组织培养与细胞培养的概念
组织培养：是指从机体内提取出组织或细 胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培 养，使之生存或生长成组织。 细胞培养：是指动植物细胞在体外条件下的 存活或生长，此时细胞不再形成组织。
植物组织培养过程
离体的植物 脱分化 器官、组织、 细胞 愈 再分化 伤 组 织 根 植 物 体
病毒载体
1 .反转录病毒（Retrovirus, RTV） 2. 腺病毒(Adenovirus, AV) 3. 腺病毒相关病毒 （Adeno-associated virus, AAV） 4. 单显性疱疹病毒 （Herpes simplex virus, HSV） 5. 痘病毒（Poxvirus, PV）
有机溶剂沉淀法
向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质 的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 主要机理： (1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数， 使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 (2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓 度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度， 降低了它的亲水性，导致脱水凝集。
2. DEAE-Dextran法
将DNA溶液溶解在TBS〔含Tris、 K＋、Na＋等〕缓冲液中，与二乙胺乙 基葡萄糖（DEAE-Dextran）混合，滴 加到受体细胞表面，供体DNA便会进 入受体细胞。
3. 脂质体转染法
脂质体是由磷脂、胆固醇或其它脂 类形成的一种可以高效包装 DNA 的人造 单层膜。其结构和性质与细胞膜极为相 似，因而二者易于融合， DNA 则由于细 胞的内吞作用而进入细胞。
2.生物制品制备基本技术
一般生物制品的制备方法 生物制品的分离纯化方法 生物制品质量检测与控制 生物制品的保存与运输
动物细胞、植物组织、 微生物培养基本技术
动物细胞培养基本概念与技术
1.动物细胞的生长与培养
动物细胞的特点


进化程度高 结构、形态、成分复杂 细胞间连接形式多样 生长相对缓慢 功能全面
植物要注意生长的季节 动物要注意年龄和性别 微生物要选取对数生长期
原料的预处理

动物：去除结缔组织、脂肪组织等， 并迅速冷冻 植物：去除不用的部分，保鲜处理 微生物：及时将菌细胞与培养液分开， 并保鲜处理
原料的保存
适用于所有的生物原料， 常用-40℃


冷冻法 有机溶剂脱水法 防腐剂保鲜
指外植体的最初培养
继代培养（Subculture）
将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中， 这种反复多次移植的培养，称为继代培养
分化培养
壮苗与生根
出瓶移栽
出瓶嫁接
微生物培养
细菌生长曲线
迟缓期 对数生长期 稳定生长期
衰亡期
微生物生长繁殖的控制
杀菌 彻底杀灭－－灭菌 溶菌 杀灭 部分灭菌－－消毒 控制害菌 抑制霉腐微生物－－防腐
培养细胞的生长和增殖过程
细胞培养是指从体内组织取出细胞 在体外模拟体内环境下，使其生长 繁殖，并维持其结构和功能的一种 培养技术。细胞培养的培养物可以
是单个细胞，也可以是细胞群
过程：
动物组织细胞间隙中 含有一定量的弹性纤 维等蛋白质，将细胞 网络起来形成具有一 定弹性和韧性的组织 和器官。
动物胚胎或幼龄动 物的组织、器官
极高的速度带入人体外的细胞内或直
接带入人体内。
6. 超声波法
超声波可对细胞膜直接作用，使 细胞膜的通透性增高， DNA 可通过扩 并且超声波可 通过培养瓶瓶壁发挥作用。
7. 受体介导法
此方法依赖于受体和配体间的特异 结合所介导的细胞内吞作用而将外源基 因导入细胞。一般是将DNA与多聚物 （如多聚赖氨酸）结合而浓缩，再结合 以一定的配体即可用于基因转移。不过 效果仍不理想。
胰蛋白酶 （分解弹性纤维）
细胞悬浮液 10代细胞 50代细胞
原代培养
细胞株 传代培养
细胞系
无限传代
接触抑制
指数生长期
培养细胞的 一代生存期
潜伏期
停滞期
体外培养细胞的种类
细胞系
细胞株
二倍体细胞
遗传缺陷细胞
肿瘤细胞
动物细胞基因表达系统

具有复杂的翻译后加工系统

糖基化以及二硫键在合成和分泌过
程中自然而然的正确形成
质 粒 穿 梭 载 体
质粒的转染（transfection）方法
1. 磷酸钙共沉淀法 2. DEAE-Dextran法 3. 脂质体转染法 4. 电穿孔法（electroporation） 5. 基因枪法 6. 超声波法 7. 受体介导法
1.磷酸钙共沉淀法
把供体DNA溶解在HEPES溶液中， 然 后 缓 慢 加 入 Na2HPO4-CaCl2 溶 液 ， 供体 DNA 便被包裹在磷酸钙溶液中， 这种共沉淀可被细胞吞噬，外源基因 便导入了受体细胞。
常用丙酮
常用乙醇、苯酚、甘油
原材料的提取




磨切法 压力法 反复冻融法 超声破碎法 酶破碎法
渗透压 高压 减压
提取时要注意
采用缓冲系统
添加保护剂
抑制水解酶
其他
防紫外线、强酸、强碱、 高温、高频振荡、氧化
2. 生物制品的分离纯化方法
细胞破碎 固液相分离 浓缩与初步纯化 高度纯化 蛋白质类制品的的分离纯化方法
亲和层析
利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为 亲和层析。 在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基 与配基结合的层析介质称为载体 亲和层析的设计原理和过程： 1)配基固定化 2)吸附样品 3)样品洗脱
L 配基 ＋ L
＋
S 样品 L
L
S
配基固定化 L ＋ S L S ＋ 杂质
吸附样品 L S L ＋ S
泵
色谱柱
溶剂
3. 生物制品质量检测与控制
生物制品质量检测包括
毒性试验
原材料
安全性
防腐剂试验
安全试验(DNA、致敏原、重金属 浓度测定 活菌率或病毒滴度测定
培养过程
纯化工艺 目的产品
效力检测
动物保护率试验 免疫抗体滴度测定
稳定性试验
生物制品的管理与控制
生物制品国家管理6项基本职能
1.完整的生物制品审批程序和审批标准的法规文件； 2.审批结论要以实验和临床试验数据为依据； 3.国家质控当局对疫苗和生物制品出厂销售实行国家批 签发制度； 4.要有对疫苗和生物制品进行质量评价的法定的实验检 定机构和实验实施； 5.对生物制品生产企业实施GMP定期检查； 6.对生物制品有效性和不良反应进行上市后检测。

产生正确折叠和完全生物活性的蛋
白质
分泌型哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源 重组蛋白直接分泌到培养基中。

N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内质 网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具 正确N端的重组蛋白质。

从内质网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产 生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程 也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。
X＋OH－ X＋
Ｘ＋
nX＋ X＋
X＋ X＋
X＋
Z＋
Z＋
X＋
X＋ X＋
X＋
X＋
Y＋
Z＋
Z＋
＋ Z Y＋
X＋ Z＋
X＋ Ｘ＋ Z＋ X＋ ＋ X ＋ ＋ Z X X＋ Y＋Y＋
Ｚ Ｚ＋
＋
X＋ X＋ 平衡上样 吸附 洗杂
洗脱
凝胶层析
将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流经体 积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。
结晶法
改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的 过程称作结晶。 （一）盐析结晶法 通过向结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解 度使其过饱和，经过一定时间后晶体形成并逐渐长大。 （二）透析结晶 （三）有机溶剂结晶 （四）等电点结晶 （五）温度诱导结晶
吸附法
吸附是物质分子在两相界面上浓度的增加。 由于界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用 力，因此界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固 体的表面力，它能从外界吸附分子、原子或离子，并 在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。我们称 物质从流动性（气或液相）浓缩到固体表面从而达到 分离的过程称为吸附作用。把在表面上能发生吸附作 用的固体称为吸附剂；将被吸附的物质称为吸附物。
预处理
上样
吸附
洗杂
洗脱
再生
离子交换法
离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子 交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作 方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静 电力。它们结合是可逆的，在一定条件下能够 结合，条件改变后也能被释放出来。离子交换 剂由惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子 组成。