第十二章免疫学应用第三节常用生物制品的制备及检验生物制品作为一类特殊的药品，其生产环节和质量检验必须按照严格的法规、程序和标准进行。

只有这样，才能保证其对动物疾病防治和诊断的可靠性和准确性，以及对人畜和环境的安全性。

生物制品种类繁多，生产中用量较大的有疫苗和免疫血清两大类。

一、疫苗的制备及检验（一）菌种、毒种的一般要求菌种、毒种是国家的重要生物资源，世界各国都为此设置了专业性保藏机构。

用于疫苗生产的菌种和毒种应该符合要求。

1．背景资料完整我国《兽医生物制品制造及检验规程》规定，经研究单位大量研究选出并用于生产的现有菌种、毒种，均由中国兽药监察所或中国兽药监察所委托分管单位负责供应，而且其分离地、分离纯化时间等背景资料必须记录完整。

2．生物学特性典型指形态、生化、培养、免疫学及血清学特性以及对动物的致病性和引起细胞病变等特征均应符合标准。

同时，用于制苗的菌种和毒种的血清型必须清楚。

3．遗传性状稳定菌种、毒种在保存、传代和使用过程中，因受各种因素影响容易变异，因此，菌种和毒种遗传性状必须稳定。

（二）菌种、毒种的鉴定与保存。

1．菌种、毒种的鉴定在疫苗生产之前，要鉴定所用菌（毒）种的毒力、免疫原性及稳定性，确定强毒菌（毒）种对本动物、实验动物或鸡胚的致死剂量，弱毒株的致死和不致死动物范围及接种的安全程度，通过强毒攻击免疫后动物，确定制造疫苗所用菌（毒）种的免疫原性；对制造弱毒活苗菌（毒）种需反复传代和接种易感动物，以检查其毒力是否异常增强。

2．菌种、毒种的保存为了保持稳定性，最好采用冷冻真空干燥法保存菌种和毒种。

冻干的细菌、病毒分别保存于4℃和-20℃以下，液氮是长期保存菌种的理想介质。

（三）灭活、灭活剂与佐剂1．灭活与灭活剂疫苗生产中的灭活是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能保持其原有免疫原性的过程。

灭活的方法有物理法和化学法两种。

加热法是一种常见的物理灭活法，但疫苗生产上主要采用化学灭活法。

用来进行灭活的试剂称为灭活剂，如甲醛、苯酚、结晶紫及烷化剂等。

其中甲醛应用最为广泛。

甲醛的灭活作用是其醛基能够破坏微生物蛋白质和核酸的基本结构，导致微生物死亡而失去感染力。

一般需氧菌和厌氧菌所用甲醛的浓度分别为0.1%～0.2%和0.4%～0.5%，37～39℃处理24h以上，如气肿疽灭活苗常用0.5%甲醛37～38℃灭活72～96h；灭活病毒所用甲醛浓度为0.05%～0.4%（多数为0.1%～0.3%），而灭活类毒素多用0.3%～0.5%甲醛。

灭活的效果与温度、pH、微生物的种类和含氮量、灭活剂的特异性及浓度以及是否存在有机物等因素有关。

通常高温与碱性环境能加速灭活，但易破坏抗原性，而含氮量较高及有机物的存在会消耗部分灭活剂，使灭活速度减慢。

2．佐剂（1）佐剂的概念本身无免疫原性，但与抗原物质合用能增强抗原的免疫原性和机体免疫应答，或改变机体免疫应答类型的物质称为佐剂。

佐剂能提高抗原的免疫原性，增加抗原分子的表面积，延长抗原在体内的存留时间，增强机体特异性及非特异性免疫反应。

佐剂必须是无毒、无致癌性及其他副作用，而且易于吸收、吸附力强的纯净化学物质。

佐剂疫苗保存1-2年后应不引起不良反应，效力无明显改变。

（2）佐剂的分类与常用佐剂佐剂可简单地分为贮存型和非贮存型两类（表12-1）。

前者常与抗原混合成悬浊状态，使抗原在注射局部存留时间延长，通过抗原的缓慢释放，持续刺激机体免疫系统；后者不与抗原混合，两者分别在机体不同部位同时注射也可发挥佐剂的作用。

氢氧化铝和白油-Span佐剂是应用最为广泛的贮存性佐剂。

氢氧化铝胶，又称铝胶，是常用佐剂之一，它既有良好的吸附性，又能浓缩抗原，减少注苗剂量。

铝胶成本低，使用方便，且基本无毒，因而是动物疫苗的常用佐剂。

我国目前在生产猪瘟-猪丹毒-猪肺疫三联苗及单价猪肺疫苗时，三联苗中的猪肺疫苗和单价猪肺疫苗，用铝胶稀释比用生理盐水稀释的免疫效果更好。

不过，铝胶也有不足之处，如易引起轻度局部反应，冻后易变性，不引起明显的细胞免疫，可能对动物神经系统有影响等。

表12-1 常见各类佐剂类型佐剂贮存型佐剂不溶性胶体Al(OH)3，AlPO4，KAl(SO4)2·12H2O，Ca3(PO4)2，炭末等油乳剂弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，Span-白油佐剂等非贮存型佐剂生物佐剂分支杆菌，卡介苗，乳酸菌类，短小棒状杆菌，葡萄球菌，链球菌，百日咳杆菌，布氏杆菌，细菌脂多糖，酵母多糖，IL-1，IL-2等非生物佐剂表面活性剂吐温-80，溶血卵磷脂类似物，溴化十八烷基三甲铵等胺及其类似物癸胺，癸胍等核酸及其类似物DNA，RNA，低核苷酸，多聚核苷酸，cAMP等白油-Span佐剂是当前的主要油乳佐剂，该佐剂用轻质矿物油即白油作油相，Span-80或Span-85及吐温-80（Tween-80）作为乳化剂。

配制时可将白油与Span-80按94∶6比例混合，再加总重量2%的硬脂酸铝溶化混匀后，116℃高压灭菌30min 即为油相，将抗原溶液和吐温-80以96∶4比例混合作为水相，再将油相和水相按1∶1比例充分混匀，达到完全均质化即可。

有研究证明，同时含油相和水相乳化剂的疫苗比仅含油相的疫苗免疫效果好，在37℃体温条件下更稳定，黏度也低。

（四）疫苗的制备（图12-1，图12-2）1．细菌性灭活苗的制备（1）种子培养选取1～3个品系毒力强、免疫原性好的菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。

种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用完。

（2）菌液培养选用固体表面培养、液体静置培养、液体深层通气培养或连续培养法，对种子液进行培养。

一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，但生产量较小，因此大量生产疫苗时常用液体培养法。

（3）灭活与浓缩灭活时要根据细菌的特性选用有效的灭活剂和最适灭活条件。

如猪丹毒氢氧化铝苗可加入0.2%～0.5%甲醛，37℃灭活18～24h。

此外，为提高某些灭活苗的免疫力，常采用离心沉降或氢氧化铝吸附沉淀等方法使菌液浓缩一倍以上。

（4）配苗与分装配苗即按比例加入佐剂，可根据具体情况在灭活同时或之后进行。

配苗须达到充分混匀，分装后立即加塞、贴签或印字。

上述制备过程都必须在无菌条件下按照无菌操作进行。

2．细菌性活疫苗的制备（1）种子液及菌液培养选择合格的弱毒菌种增殖培养形成种子液，种子液在0～4℃可保存2个月。

按1%～3%的比例将种子液接种于培养基，依不同菌苗的要求制备菌液。

如猪丹毒弱毒苗在深层通气培养中要加入适当植物油作消泡剂，并通入过滤除菌的热空气。

菌液于0～4℃暗处保存，经抽样无菌检验、活菌计数合格后使用。

（2）浓缩、配苗与冻干利用吸附剂吸附沉降和离心沉降等方法浓缩菌液可以提高单位活菌数，增强疫苗的免疫效果。

浓缩菌液应抽样作无菌检验及活菌计数。

将检验合格的菌液按比例加入冻干保护剂（如5%蔗糖脱脂乳）配苗，充分摇匀后立即分装。

随后将菌苗迅速放入冻干柜预冻和真空干燥，并立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存后由质检部门抽样检验。

3．病毒性组织苗的制备（1）种毒与接种可选用抗原性优良、致病力强的自然毒株的脏器组织毒作为种毒，也可选用强毒株的增殖培养物，还可选用弱毒株组织毒种作为种毒，但都必须经纯度检验及免疫原性检验合格后才能使用。

被接种的动物应该是清洁级（二级）以上，且对种毒易感性高的动物，接种途径可依生产目的和病毒性质分别选用脑内、静脉、肌肉、皮下或腹腔注射等，如狂犬病疫苗是用兔脑毒种通过绵羊脑内接种途径获得。

此外，接种后应每天观察和检查动物的各项指标，如精神、食欲和体温等。

（2）收获与制苗根据观察和检查的结果选出符合要求的发病动物按规定方式剖杀，收集含毒量高的组织器官，如兔出血症组织灭活苗常收获病兔肝脏。

制备弱毒苗需按无菌操作剔除脏器上的脂肪与结缔组织，称重后剪碎并加适量保护剂制成匀浆，过滤和适当稀释后加余量保护剂及青霉素和链霉素各500～1000IU/ml，充分摇匀并置0～4℃处理，再检验纯度并测定毒价，合格者分装并冻干。

制备组织灭活苗可收获组织脏器，经纯度检验和毒价测定，合格者按比例加平衡液和灭活剂制成匀浆，分装和标记，0～4℃保存。

4．病毒性禽胚苗的制备（1）种毒与接毒目前，痘病毒、鸡新城疫、禽流感等疫苗仍利用禽胚特别是鸡胚制备。

适应于鸡胚的种毒多系弱毒且为冻干毒种，使用前需在鸡胚上继代复壮3代以上和检验合格后方可用于生产。

用于接毒的鸡胚必须来自SPF(无特定病原动物)鸡群，以免除母源抗体及残留抗生素的影响。

常用的接种途径有：卵黄囊接种（5～8日龄鸡胚）、尿囊腔接种（9～11日龄鸡胚）、羊膜腔接种（10～12日龄鸡胚）、绒毛尿囊膜接种（11～13日龄鸡胚），接种后观察胚的活力，记录鸡胚死亡时间。

（2）收获与配苗通常选择接毒后48～120h内死亡的鸡胚，收获的组织依接种途径、病毒种类而定，主要有绒毛尿囊膜、尿囊液、羊水及胎儿，冷却后经纯度检验，按比例加入抗生素后方可用于制造湿苗或冻干苗。

5．病毒性细胞苗的制备（1）培养液与细胞培养液包括细胞培养液与病毒增殖维持液，前者含5%～10%血清，而后者血清仅含2%～5%。

常用的细胞培养液有MEM、DMEM 等。

制造疫苗用细胞通常有原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系。

常选用来源广、生命力强及病毒适应性强的细胞，如鸡胚成纤维细胞(生产鸡新城疫I系苗)、地鼠肾细胞(BHK21细胞)以及非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)等培养病毒。

（2）接毒、收获和配苗将种毒继代培养在适宜细胞的单层培养物上，适应后用作毒种。

通常先培养出完整的细胞单层，倾去培养液，然后接种病毒，如猪水疱病弱毒病毒，待病毒吸附后加入维持液继续培养，待出现70%以上细胞病变时即可收获病毒，这称为异步接种。

有的病毒采取同步接种，即在接种细胞同时或不久接种病毒，使细胞和病毒同时增殖，如细小病毒，培养一定时间后收获。

收毒的时间和方法依疫苗性质而定，有的将培养瓶冻融数次后收集，或者加入EDTA-胰蛋白酶液将细胞消化分散后收取。

收获的细胞毒经纯度检验和毒价测定合格后，按常规方法配制灭活苗或冻干苗。

（五）成品检验成品检验是保证疫苗品质的重要环节，一般由专门机构在接到检验通知书后执行。

按规定需对产品随机抽样，分别用于成品检验和留样保存。

我国规定灭活苗在500L以下、500～1000L以及1000L以上者分别每批抽样5瓶、10瓶和15瓶；冻干苗每批5瓶。

抽样后必须在规定期限内进行检验和出示结论。

1．纯度检验及活菌计数（1）纯度检验即无菌检验。

活菌苗及灭活苗灭活之前不得混有杂菌,为此，必须进行纯度检验。

凡含有防腐剂、灭活剂或抗生素的疫苗需用培养基稀释后再移植培养。

不同疫苗无菌检验所用培养基种类不同，通常选择最适合各种容易污染的需氧或厌氧杂菌生长而不适宜活菌苗细菌的培养基，如马丁肉汤琼脂斜面、普通琼脂斜面、血琼脂斜面及厌气肉肝汤和改良沙氏培养基等，分别将被检物0.2～lml接种到50～100ml培养基中。