focusing）等。
（4）亲和层析法（affinity chromatography）
➢大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与 底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它 们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层 析分离技术称为亲和层析。
➢亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很 广泛的分离方法之一。
（ Fig1. Mechanism of AC）
抗原
专一 抗体
基质
（Fig2. 子
4）配基的种类 (sorts of ligand) ➢抗原与抗体。 ➢DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 ➢酶与其底物。 ➢激素与其受体。 ➢维生素与结合蛋白。 ➢糖蛋白与植物凝集素。
氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它
们具有等电点，在离开等电点的pH时便会带正或
负电荷。例如某蛋白质等电点为7.0，当溶液pH 为4.0时，分子则带有正电荷。由于具有该性质， 利用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用
电学性质进行分离的方法有离子交换柱层析法 （ ion-exchange chromatography ） 、 电 泳 法 （ electrophoresis ） 、 等 电 聚 焦 法 （ isoelectric
溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙 酮等）。
②考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时 间。
③注意提取的温度、pH、变性剂等因素。
三、蛋白质类制品的分离纯化方法（
Isolation and depuration of protein production）
包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有：
盐析法原理
中性盐
蛋白质
中和电荷
水化层减弱
溶解度下 降，沉淀
等电点沉淀法
在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子 净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在 溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作 用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋 白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。
（1）原料选择 原料的选择原则： ①有效成分含量高，新鲜； ②原料来源丰富，产地较近； ③原料中杂质含量少； ④原料成本低等。
原料的选择注意事项： ①植物原料生长的季节性；
②微生物原料的对数期； ③动物原料的年龄与性别。
（2）原料的预处理与保存：
①动物原料：采集后要立即处理，去除结缔 组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。
亲和色谱（affinity chromatography）
1）基本概念（basic concept） ➢亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基之间特 异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术。 ➢配基（ligand） ：被固定在基质上的分子称为配基， 配基和基质是以共价键结合的。 ➢基质（matrix）：亦称为载体（vector），是构成固 定相的骨架 。
②压力法，有加压、减压、渗透压三种
③反复冻融法，设备简便，活性保 持好，但用时较长。
④超声波振荡破碎法，该方法破碎 效果较好，但由于局部发热，对 活性有损失。
⑤自溶法或酶解法，用得较少。
（2）提取（extraction）
生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时 ，首先要根据活性物质的性质，
①选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲
②植物原料：要择时采集并就地去除不用的 部分，保鲜处理；
③微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分 开，进行保鲜处理。
原料的保存方法主要有：
①冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-
40℃速冻。
②有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。
该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物 质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。
(2) 按分子大小分离的方法：有超滤法（ ultrafiltration）和透折法（dialysis）（即 膜分离方法）、凝胶层析法（gel chromatography）、超速离心法（ultra centrifugation转速大于20 000r/min）等。 其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓 缩、分级和脱盐。
③防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用
于液体原料，如发酵液、提取液等。
二、生物制品的提取（extraction）
(1)生物组织与细胞的破碎（obtrude of tissue and cell）：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要 提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方 法：
①磨切法，该法属于机械破碎方法，设备有组织捣碎 机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。
2）亲和层析有如下特点 （Characteristics of Affinity
Chromatography）
➢ 纯化过程简单、迅速； ➢ 分离效率高； ➢ 产物纯度高； ➢ 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定
的层析条件。 因此应用范围受到一定的限制。
3）亲和层析的基本原理 （Mechanism of Affinity Chromatography）
➢①亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性 载体相连作为固定相吸附剂。 ➢②当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相 时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被 固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流 动相流出。 ➢③然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。 （见Fig1、Fig2）。
(1)沉淀法（precipitation）：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉
淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用 的有盐析法（salting out）、有机溶剂沉淀法（organic solvent precipitation）、等电点沉淀法（isoelectric precipitation）、与 靶物质结合沉淀法（如抗体—抗原）（target banding precipitation）等。
凝胶层析又称分子筛层析，主要根据混合物中分子的大小和形 状不同 ，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的 目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔， 流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝 胶颗粒间隙流动，流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。
(3)按分子所带电荷进行分离的方法