ddNTP的特点
ddNTP 3’位不是OH，但5’磷酸基 团正常。
DNA聚合酶不 能够区分dNTP 和ddNTP。
ddNTP参入到寡 核苷酸链的3’末端 后，DNA链的延 长会被迫停止。
聚丙烯酰胺凝胶电泳特点
精度相当高！ 能分离长度达 300-500个碱基， 而差别仅一个 碱基的同系单 链核苷酸序列。
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
加加 热入 ，引 退物 火，
带引物的模板单链DNA
链延伸---终止反应
核素标记的dNTP
分成四管 双 双 双双 脱 脱 脱脱 氧 氧 氧氧 鸟 腺 胸胞 苷 苷 苷苷
双脱氧末端终止法
测序的原理
主讲：氧气yun
Frederick Sanger
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基
ddNTP——双脱氧 核苷酸
基本原理：
DNA复制
ddNTP的结构
聚丙烯酰胺凝胶 电泳
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶 底物：dNTP 模板：单链DNA 引物：需要 引物的作用：提供3’羟基 末端
EDTA
乙二胺四乙酸，
一种二价金属
离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
聚丙烯酰胺凝胶电泳
95℃加热 变性
冰上冷却 点样
开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
放射自显影
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
Байду номын сангаас
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。