成体人牙髓干细胞的分离与鉴定杨雪超樊明文武汉大学口腔医学院(430079)email:yangxuecao@摘要：目地从成人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，研究其生物学性状。
方法选取年青患者因正畸拔除的完好牙齿，取出牙髓，采用酶消化及过滤的方法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。
扩大培养细胞克隆，体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性,矿化结节形成，牙本质唾蛋白表达，Hoechst33342染色，Oil Red-O 染色，PPARr2基因表达等方面进行检测。
结果在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP 活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达牙本质唾蛋白，已向成牙本质细胞方向发生了分化。
Hoechst33342染色大部分细胞为阴性。
成脂肪诱导后，Oil Red-O染色阳性，检测到PPARr2基因表达。
结论从成体人牙髓组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，能够进行分化，为进一步的深入研究奠定了基础。
关键词：成体人牙髓干细胞牙本质唾蛋白成牙本质细胞1．引言目前普遍认为，干细胞是具有无限或很强自我更新能力细胞，能分化产生至少一种高度分化的后代细胞。
干细胞应具有两个基本性质：（1）自我更新能力，能通过分裂维持自身群体的稳定；（2）分化能力，在一定条件下能分化产生具有特定功能的细胞[1]。
干细胞又分为胚胎干细胞和成体干细胞两类，后者是目前研究的新热点。
研究表明，皮肤[2]，乳腺[3]，肌肉[4]，甚至神经组织[5]等成熟组织器官中都存在成体干细胞（adult stem cell）。
最近，国外学者证实成人牙髓组织中也存在干细胞[6]，国内关于此领域的研究尚刚刚起步，本文是系列研究的第一步，旨在探寻一条分离牙髓干细胞的可靠途径，为更深入的研究奠定基础2．材料和方法2.1 材料α-MEM培养基，特极胎牛血清（Hyclone, USA）; collagenase type Ⅰ,dispase(Sigma,USA);ALP检测试剂盒（南京建成）；β-甘油磷酸钠（进口分装）；兔抗人DSP抗体（NIDCR LW.Fisher 博士惠赠）；FITC标记二抗（武汉博士德）；Oil Red-O，IBMX, Hoechst33324(Sigma,USA)；One-Step RT-PCR试剂盒（Promage）2.2 方法2.2.1细胞培养和克隆采用临床19-29岁因正畸或阻生需要拔除的健康第三磨牙，依照文献方法无菌条件下取出完整牙髓[7]。
将牙髓剪碎，加入50倍体积的0.2% collagenase typeⅠ及0.2% dispase（体积比1︰1），37℃水浴摇床消化1小时，1000rpm/min离心10分钟，去上清。
培养液（含20%胎牛血清）重悬沉淀，用100μm钢网过滤重悬液，获得单细胞悬液。
细胞计数板计数- 1 -细胞浓度，调整后以1－2个细胞／孔的浓度接种于96孔板，常规培养7-14天，至出现细胞克隆（细胞数≥50为判定标准），扩大培养。
2.2.2 Hoechst33342染色成功扩大培养的细胞克隆，取其第四代接种于6孔板，常规培养24小时，更换培养液（无血清的α-MEM，含0.12μg/ml Hoechst33342），37℃暗处孵育30分钟后1.5％冷福尔马林固定15分钟，冷PBS充分漂洗。
倒置荧光显微镜下340nm波长光激发后观察荧光表达情况，以正常牙髓成纤维细胞作为对照。
2.2.3 细胞的定向诱导分化成功扩大培养的细胞克隆，待生长至90%汇集，0.15%胰酶消化后，以5x103/cm2接种于6孔板和24孔板。
传代后第二天改为诱导液培养（矿化液为含10%胎牛血清，50μg/ml α-抗坏血酸，10mMβ-甘油磷酸钠的α-MEM；脂肪分化体系为含10%胎牛血清，10－6M 地塞米松，0.5mM IBMX，0.1mMα-抗坏血酸的α-MEM）。
2.2.4 碱性磷酸酶（ALP）活性细胞接种于24孔板，矿化液连续培养14天，弃去矿化液，0.01M冷PBS冲洗三遍，每孔加入细胞裂解液200μL，室温振荡10分钟，收集上清液。
按照试剂盒说明检测细胞的ALP活性。
2.2.5 矿化结节细胞接种于6孔板，矿化液连续培养14天，中止培养，0.01M冷PBS冲洗三遍，4%中性福尔马林固定后进行Von Kossa染色，具体方法参见文献[8]。
2.2.6 牙本质唾蛋白（DSP）的检测细胞接种于6孔板，每个克隆有5个复孔，一部分细胞加矿化液连续培养；对应复孔细胞则用常规培养液培养。
14天行DSP免疫荧光染色。
具体操作步骤为：冷PBS洗去细胞表面培养液，以4%中性福尔马林固定15分钟后，-20℃甲醇继续处理10分钟；正常山羊血清封闭20分钟，兔人DSP特异性抗体4℃孵育过夜，PBS洗3次；FITC标记二抗37℃作用30分钟，PBS洗3次；水性封片剂封片，荧光显微镜下观察。
取矿化诱导前后细胞蛋白样品20μg经5－12％ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜。
用1％BSA室温孵育1h，以封闭非特异性结合位点，加入兔人DSP特异性抗体4℃过夜。
根据相应的二抗及三抗，DAB显色5～10分钟，观察Western blot结果。
2.2.7 Oil Red-O 染色经脂肪分化体系诱导培养21天后，部分细胞4％中性福尔马林固定10分钟，Oil Red-O 染液常温孵育1小时，充分漂洗后镜检，以正常牙髓成纤维细胞作为对照。
2.2.8 PPARr2基因的表达提取培养细胞总RNA，参考Genebank检索数据设计PPARr2特异性引物，上游：5' CTCCTATTGACCCAGAAAGC 3'，下游：5' GTAGAGCTGAGTCTTCTCAG 3'。
RT-PCR检测PPARr2基因的表达。
反应条件：50℃ 30min逆转录，94℃2min逆转录失活，然后94℃45s，56℃ 45s，72℃ 60s，35个循环，72℃延伸7min。
PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳分析，并纯化后测序。
以正常人脂肪细胞细胞作为阳性对照。
3. 结果3.1 细胞生长和形态通过消化和滤网过滤，细胞皆以单细胞方式贴壁生长，24小时内呈类圆形或不规则形，伸展不完全；24小时后少数单个细胞开始分裂增殖[图一]，7天后少数细胞增殖能力旺盛形成克隆[图二]，细胞克隆呈三角形，多角形等多种形态，但都有一共同特点——从中心向四周放散生长。
消化分散后，多数细胞能够形成克隆[图三]。
3.2 Hoechst33342染色体外培养的第四代克隆来源细胞经Hoechst33342染色后，大部分细胞荧光表达阴性或弱- 2 -阳性[图四]；而对照组绝大多数细胞为阳性表达。
3.3 ALP活性与矿化结节克隆来源细胞用矿化液连续培养14天，肉眼观可见白色点状物，倒置显微镜下细胞呈复层生长，局部形成白色的矿化结节，Von Kossa染色显示其中央区为紅黑色，周围逐渐变浅[图五]。
对照组细胞虽然也可以形成细胞结节，但Von Kossa染色阴性，证实无矿化形成。
细胞经14天矿化液诱导培养后，其ALP活性与矿化结节的形成能力存在正相关。
t检验结果表明[表一]克隆来源细胞细胞的ALP活性皆明显高于对照组细胞（P<0.05）。
表1 细胞ALP活性比较（X±S）细胞n ALP活性（U/gpro）克隆来源对照组 242442.37±1.9822.34±2.09 **P<0.053.4 DSP的表达荧光显微镜下观察，克隆来源细胞经矿化液诱导培养14天后，DSP染色强阳性，细胞呈明亮绿色[图六]；未用矿化液诱导的复孔细胞及对照组细胞染色很弱，呈现模糊的暗暗绿色背景。
Western blot检测显示，矿化诱导后克隆来源细胞可见95KD处有DSP条带出现，诱导前则无[图七]。
结果表明，克隆来源细胞经矿化液诱导培养后，有体外合成分泌DSP的能力，而DSP是目前衡量向成牙本质细胞分化成熟的一个最重要指标，从而证明细胞具有向成牙本质细胞分化的能力。
3.5 成脂肪分化检测克隆来源细胞经成脂肪分化体系诱导培养21天后，光镜下可见细胞胞体明显肥大，折光度增加，富含脂滴并形成特殊的“鸡尾样”结构[图八]，Oil Red-O 染色阳性[图九]，而对照组细胞为阴性。
RT-PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析，结果在340bp处有一特异性扩增条带（图十），与阳性对照条带相同，经测序后发现产物为PPARr2基因序列，说明诱导后有PPARr2基因的表达。
4.讨论成体干细胞是近年来干细胞研究领域的新热点，一方面这是对传统发育生物学观点的革新[9]；另一方面由于利用胚胎干细胞面临复杂的伦理学问题和实际操作中的困难，因而对成体干细胞的研究及应用就更具有深远的意义。
目前已经证明，在机体许多成熟组织器官中存在成体干细胞，关于牙髓干细胞的研究是在口腔医学领域刚刚开始的一个热点。
Gronthos等人[6，10]最早对人牙髓干细胞进行了研究，从成体牙髓组织中分离出的克隆形成细胞具有向成牙本质细胞分化的能力，首次证明了成体牙髓干细胞的存在。
本研究在此基础上对此克隆形成细胞体外诱导分化，通过ALP活性，矿化结节形成和DSP的表达三个方面检测向成牙本质细胞方向分化的能力；通过Oil Red-O 染色和PPARr2基因表达检测向脂肪细胞横向分化的能力。
成牙本质细胞的主要功能是形成牙本质，ALP是参与骨等矿化组织代谢和再生的一种功能性标志酶，也参与牙本质的形成。
研究表明，牙乳头外胚间充质细胞向成牙本质细胞分化的过程中分泌矿化前基质，在ALP等矿化因子作用下最终形成牙本质[11]，成牙本质细胞具有较高水平的ALP活性。
本研究中，在矿化液诱导条件下，克隆来源细胞ALP活性水平显著高于对照组细胞，同时能够复层生长形成矿化结节，这初步证实这五组克隆具有形成牙本- 3 -质的能力。
牙本质唾磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）基因编码表达牙本质唾蛋白(DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein,DPP),皆是唯一由成牙本质细胞合成和分泌的，只在牙本质中存在的蛋白，属于牙本质特异性基质非胶原蛋白，目前认为其是成牙本质细胞的特异性标志物[12]。
过去由于缺乏特异性抗体来检测DSP的表达，多采用RT-PCR方法在mRNA 水平进行检测，但蛋白质水平检测始终是衡量分化成熟的金标准。
本研究中使用NIDCR提供的兔抗人DSP抗体，采用免疫荧光法在蛋白水平检测DSP的表达，克隆来源细胞诱导后呈阳性着色，能够表达DSP；诱导前则着色阴性，不能够表达DSP，这一转变正是一个分化的过程。