培养细胞传代与计数
细胞培养的基本概念
• 传代：
• 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 • 原代培养 • 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培
养。
•
接触抑制（Contact inhibition）
• 细胞相互接触时，将停止增长； • 细胞停留在细胞周期的G0期； • 转化的细胞却可以继续生长导致
细胞系
克隆
（cell line）从 肿瘤组织培养建 立的细胞群或培 养过程中发生突 变或转化的细胞， 在培养条件下可 无限繁殖
（clone）亦称无性繁殖 系或无性系。对细胞来 说，克隆是指由同一个 祖先细胞通过有丝分裂 产生的遗传性状一致的
细胞群。
细胞系资源
• The American Type Culture Collection (ATCC) • The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) • National Institute of Health (NIH), USA • National Cancer Institute (NCI), USA
④统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移 动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含 有16个小格）中被染液染上色的细胞数目。 ⑤按照公式计算细胞密度。
• 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
• 潜伏期
• 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为6～24小时。
• 对数生长期：
• 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 • 细胞周期研究：细胞周期同步化
• 停止期（平台期）：
• 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 • 机制：接触抑制、密度依赖性
培养细胞的计数的意义
• 在细胞生物学及分子生物学实验中，往往要进行细胞的计数、调 整细胞的密度，才可进行后续的实验操作（如：细胞增殖、转染、 流式细胞术等），因此是必不可少的一种基本技能。
血球计数板
细胞计数图示
细胞计数
①将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上； ②将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片与计数 板之间； ③静置3分钟； ④镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计算左侧和 上方的。然后按如下公式计算：
细胞重叠堆积生长。
细胞传代次数（Passage Number）
• 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为 “ Hayflick极限”。
• 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传 代140次。
• 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年， 10-30代；早老病儿童，2-10代。
• 游离期： • 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体
呈圆球形。
• 10分钟——4小时
• 贴壁期：
• 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 • 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等
• 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电 荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
细胞数/mL=（4大格细胞总数/4）×10000 （/4因为计数了4个大格的细胞数；×104因为计数板中每一个大格 的体积为：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3 ）
细胞计数图示
实验注意事项与要点
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数 目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中； 2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意 每次取样都要混匀，以求计数准确； 4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细 胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线， 不计左线。 5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则 要重新计数。
• 有限细胞系，无限细胞系 • 细胞系 • 细胞株
培养细胞的特性
• 培养细胞的生长方式
• 贴附生长： • 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 • 悬浮生长： • 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统
肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
• 游离期 • 贴壁期 • 潜伏期 • 对数生长期 • 停止期（ulture）从动物 机体取出的进行培养的细胞 群。生长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以内）停 止生长。
细胞株
（cell strain）从原 代培养细胞群中筛 选出的具有特定性 质或标志的细胞群， 能够繁殖50代左右， 在培养过程中其特 征始终保持。
实验步骤
①取一瓶传代的细胞，待长成单层后以被使用。用0.25％的胰蛋白酶液消化、 PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待 测细胞悬液。
②取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上. ③吸取10μL细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬 液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡， 也不能让悬液流入旁边槽中。