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高效液相色谱法简介


高效液相色谱仪一般可分为四个主要
部分:高压输液系统,进样系统,分离系
统和检测系统。此外还配有辅助装置:如
梯度淋洗,自动进样、馏分收集及数据处
理等。
1、高压输液系统
1 ) 贮 液 器 : 1-2L 的 玻 璃 瓶 , 配 有 溶 剂 过 滤 器 (Ni合金),其孔很小约2 m,可防止颗粒物进
入泵内。 2)脱气:超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜,相对分子量小的气体透 过膜从溶剂中除去(气泡会影响检测)。
高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱
法,它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流 动相相间分配系数或吸附系数的差异,将各组分分 离后进行定性、定量分析。
发展历史
20世纪初,俄国植物学家茨维特提出经典液相色 谱法。
1960年代,由于气相色谱对高沸点有机物分析的 局限性,为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大 分子物质,气相色谱的理论和方法被重新引入经 典液相色谱。
(使用较多)
ห้องสมุดไป่ตู้对流量变化敏感的检测器会有噪声
干扰,此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定,但流量不恒定(现在已经较少使用)。
输液泵操作注意事项:
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
4)梯度淋洗装置:
3)高压泵
输液泵应具备如下性能:①流量稳定②流量范 围宽③输出压力高,一般应能达到150~300 kg/cm2;④液缸容积小;⑤密封性能好,耐腐蚀。
高压泵按排液性质可分为:恒压型和恒流型。
注射型泵------输出精确,无脉动,需更换溶剂而中断工作。
◆恒流泵
往复型泵------造价低廉,溶剂更换方便,但存在脉动。
发展趋势: 填料粒度小 柱径小
装柱技术:干法:填料粒度大于20m时可用。
湿法(匀浆法):配成悬浮液。高压泵压入 色谱柱,洗净备用
4、检测系统
检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用 是把洗脱液中组分的量转变为电信号。
要求:
灵敏度高 噪音低(即对温度、流量等外界变化不敏感) 线性范围宽 重复性好 适用范围广
分类:
1)按原理可分为光学检测器(如紫外、荧光、示差折
光、蒸发光散射)、热学检测器(如吸附热)、电化学检 测器(如极谱、库仑、安培)、电学检测器(电导、介电 常数、压电石英频率)、放射性检测器(闪烁计数、电子 捕获、氦离子化)以及氢火焰离子化检测器。
1960年代末,科克兰(Kirkland)、哈伯、荷瓦 斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界 上第一台高效液相色谱仪,开启了高效液相色谱 的时代。
20世纪70年代,高效液相色谱法开始广泛应用。
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150~300 kg/cm2。色谱
柱每米降压为75 kg/cm2以上。
图 六通进样阀
3、分离系统
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。
色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛
板(滤片)、接头、螺丝等组成。色谱柱一般用
内部抛光的不锈钢制成。其内径为2~6mm,柱长 为10~50cm,柱形多为直形,内部充满微粒固定
相。柱温一般为室温或接近室温。
色谱柱
标准柱型: 4.6mm或 3.9mm L: 15-30cm 填料粒度:5-10m
HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)
洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期
内流动相组成保持恒定,适合于组分数目较少,
性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分
析周期内程序控制流动相的组成,如溶剂的极 性、离子强度和pH值等,用于分析组分数目多、 性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以 缩短分析时间,提高分离度,改善峰形,提高 检测灵敏度,但是常常引起基线漂移和降低重 现性。
高速——流速为0.1~10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中
同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
第二节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪基本装置
检测器 进样阀 色谱柱
流动相 高压泵 注入样品液
流出液
色谱处理机
高效液相色谱仪的组成
梯度洗脱有两种实现方式:
一是高压梯度(内梯度),利用两台高压输液泵,将两种不同
极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室,混合均匀后再进入色谱柱。
二是低压梯度(外梯度),通过比例调节阀,将两种不同极性
的溶剂按一定的比例抽入一台高压泵中混合,随后打入色谱柱。
高压梯度
低压梯度
2、进样系统
早期使用隔膜和停流进样器,装在色谱 柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动 进样器。进样装置要求:密封性好,死体积 小,重复性好,保证中心进样,进样时对色 谱系统的压力、流量影响小。
(3)自动进样。用于大量样品的常规分析。
(4)阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀,其关
键部件由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。 由于阀接头和连接管死体积的存在,柱效率低于隔膜进样 (约下降5~10%左右),但耐高压(35~40MPa),进样 量准确,重复性好(0.5%),操作方便。
HPLC进样方式可分为:
(1)隔膜进样 (2)停流进样 (3)自动进样 (4)阀进样
(1)隔膜进样。使用微量注射器进样。装置简单、
死体积小。但进样量小且重现性差,常规分析使用受 到局限。
(2)停流进样。可避免在高压下进样。但在
HPLC中由于隔膜的污染,停泵或重新启动时往往会 出现“鬼峰”;另一缺点是保留时间不准。在以峰的 始末信号控制馏分收集的制备色谱中,效果较好。
高效液相色谱法
High-Performance Liquid Chromatography,HPLC
主要内容
第一节 概述 第二节 高效液相色谱仪 第三节 高效液相色谱类型 第四节 固定相和流动相的选择 第五节 图形结果分析及其应用
第一节 概述
高效液相色谱(HPLC)也叫高压液相色
谱(high pressure liquid chromatography)、高速 液相色谱(high speed liquid chromatography)、 高分离度液相色谱(high resolution liquid chromatography)等。
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