• 基因表达的必要条件
应用原理简述如下：
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶 表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。 （2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共 转染实验需要的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启 动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与 转录因子的作用强度成正比。 （3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应， 产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活 性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
质粒共转染
Luciferase assay
裂解细胞，添加buffer以及底物荧光素
底物过剩的情况下，转录 因子的作用越强，荧光素 酶表达量越高，萤光越亮。
Promega双萤光素酶检测试剂盒操作步骤：
1.制备细胞裂解液：加入足够的1X裂解缓冲液（室温平衡）以覆盖 细胞（如：六孔板加200ul） a.对于贴壁细胞，在吸尽细胞培养液后可以直接加入报告基因细 胞裂解液。 b.晃动培养皿数次以保证裂解缓冲液完全覆盖细胞。将细胞从培 养皿刮下。将细胞及所有的液体转移至一个离心管中。将离心管 置于冰上。 旋涡震荡离心管5-10 秒钟，然后以 12,000 x g 离心 15 秒钟（室温）或长至2 分钟（4℃）。将上清液转移至一个新 的试管中。 2.融解荧光素酶检测试剂，并达到室温。 3.按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测 定时间设为10秒。 4.每个样品测定时，取细胞裂解液20ul，加入100ul荧光素酶检测试 剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。 以报告基因细胞裂解液为空白对照。 5.归一化=RLU萤火虫荧光素酶/RLU海肾荧光素酶
报告基因的特点： 1. 全序列已测定和已被克隆； 2. 表达产物在受体细胞中无内源表达； 3. 其表达产物能进行定量测定。 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功 能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因 子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的 序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和 顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑 制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异 顺序结合的重要手段。
启动子克隆与荧光素酶报告 基因分析
2015-01-17 HZ-CRC 主讲：郑琳
启动子
实验原理
启动子定义：RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。 启 动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录） 的起始时间和表达的程度。
荧光素酶报告基因
Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测 萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光 素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的 过程中，会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪也称化 学发光仪(luminometer) 测定luciferin氧化过程中释放的生物 荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、 高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子 区DNA相互作用的一种检测方法。
• 荧光素酶报告基因的表达
Aபைடு நூலகம்P+O2+
AMP+
+
技术流程：
（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因 子结合位点。 （2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动 子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3basic）中。 （3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。 （4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载 质粒对照，提纯备用。 （5） 培养目的细胞，并接种于24孔板中，生长10-24小时 （80%汇合度）。 （6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。 （7）裂解细胞并用于荧光素酶检测。 （8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。 （9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。