第五章基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。

基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。

在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。

有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。

基因克隆的一般程序为：一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。

获取目的基因的主要方法：1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。

该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。

原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。

2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。

此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。

因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。

3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。

在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。

4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。

用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。

用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。

二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。

为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。

理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。

常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。

由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。

1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。

质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在宿主细胞的拷贝数高；在复制子外适当位置有由多个单一内切酶位点组成的多克隆区，极有利于外源DNA片段的插入；具有抗药性及插入失活标记，可以从平板中直接筛选阳性重组子。

但由于质粒分子太小，只能接受小于15kb的外源DNA片段的插入。

因此，插入片段过大，会导致重组子扩增速度减慢甚至插入片段丢失。

2、噬菌体载体目前使用的噬菌体载体主要有λ噬菌体、Cosmid及M13噬菌体等。

λ噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其基因组为线状双链DNA分子。

在λ噬菌体DNA(λDNA)的中间1/3处，是可被替换而不影响噬菌体生长的“非生活区”，此区的DNA可通过遗传工程技术由外来DNA片段所替代。

λDNA作为载体的优点是：在体外可包装成病毒颗粒高效地感染大肠杆菌；载体容量大，可将23~25kb的外源DNA片段引入其内；筛选和保存较为方便。

M13也是大肠杆菌噬菌体，其基因组为单链线性DNA分子。

感染大肠杆菌后，此单链DNA 转变为复制型双链DNA。

克隆复制后，仍以单链形式包装成新的噬菌体释放到介质中。

M13DNA 分子中有一长507个核苷酸的小“非生活区”可以被外来DNA片段取代。

M13载体的主要优点是重组的M13DNA仍为单链结构，所以能方便地用于Sanger双脱氧法测定所克隆DNA片段的序列，或用于合成RNA探针的模板。

M13载体的主要问题是容量太小，当插入片段大于1000个核苷酸时就很不稳定，容易在增殖的过程中丢失。

Cosmid载体从结构上看成是一种人工构建的杂种载体，由噬菌体DNA和质粒DNA的某些功能片段拼接而成，其转染细胞及病毒颗粒包装与λDNA相似，但在细胞内的复制则与质粒相同。

与λDNA相比，Cosmid的主要优点是载体容量很大，插入DNA片段的长度可高达45kb。

三、构建重组体DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。

这种由两种不同DNA片段重新组合而成的DNA称重组DNA，简称重组体。

连接方式有粘端连接和平端连接等多种形式。

（1）粘端连接：用相同的限制性内切酶酶切目的基因和载体DNA分子，使之产生相同的粘性末端，在适当的温度下，两种DNA分子的粘性末端互补配对，再用DNA连接酶共价连接，成为完整的重组体。

由于粘端连接具有很高的重组效率，在实验中为首选方法。

许多情况下，目的基因上找不到适当的与载体上相同的限制性酶切位点。

此时可通过在目的基因两端连上人工接头(含适当限制性酶切位点的合成DNA小片段)，再经酶切后即可得到所需的粘性末端。

（2）平端连接：在目的基因和载体分子上找不到匹配的限制性酶切点时，可采用平端连接法。

少数酶酶切后能直接产生平末端，多数情况下先酶切产生粘性末端，再通过补平反应后成为带平末端的分子。

虽然平端连接有更广的适应性，但重组效率远不如粘端连接，阳性重组子筛选的难度也更大。

四、将重组DNA引入宿主细胞现用原核宿主细胞以大肠杆菌(E·coli)为主。

在基因工程中，由于重组DNA是体外制备的，将其转入宿主细胞后，可能会受到宿主细胞限制酶的切割。

因此宿主菌必须是无限制基因(或作用)的突变株(r—株)，如常用的E·coli株HB101，DH1等。

一般将噬菌体DNA引入宿主细胞称为转染(transfection)，将质粒DNA引入宿主细胞称为转化(transformation)。

在导入重组DNA前，宿主菌用冷CaCl2溶液处理，使其细胞膜透性增加而成为感受态细胞，以利于重组DNA分子的进入。

五、筛选与鉴定重组体克隆两者相辅相成，互相验证。

阳性重组体的筛选可利用载体上的遗传标志，包括抗药性(采用无抗药性的受体菌)、氨基酸合成酸系(用缺该酶系的异养型受体菌)和颜色反应(如α互补效应)等。

另一种筛选方法是菌落杂交，将平皿上的转化菌落转印到硝酸纤维膜上，经碱处理使DNA变性，然后用目的基因的标记探针与之杂交，漂洗去多余的探针后进行放射性自显影，根据显影片上的斑点可判断含有目的基因的菌落。

重组DNA的鉴定有多种方法，如限制性酶切图谱、DNA测序，Southern印迹杂交等，可根据情况酌情使用。

实验十三质粒DNA的小量快速提取原理在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当用酸性的高盐缓冲液将pH中和至中性时，变性的质粒DNA 又恢复到原来的构型并溶解在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。

通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

上清液中的质粒DNA因不溶于70％的乙醇，可在加入乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀。

试剂1、LB培养基蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加重蒸水950ml，待完全溶解后，用1N NaOH调pH 至7.0，补加重蒸水至总体积1000ml，151bf/in2高压蒸气灭菌20分钟。

2、氨苄青霉素：100mg/ml3、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris—HCl(pH8.0)；10mmol/L EDAT(pH8.0)4、溶液Ⅱ(临用时配)：0.2mol/L NaOH，1％SDS5、溶液Ⅲ：0.5mol/L乙酸钾60ml；冰乙酸11.5ml；H2O28.5ml6、酚－氯仿：将酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/L Tris－HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖0.01mol/L Tris－HCl (pH7.6)液层，4℃保存。

7、氯仿－异戊醇：将氯仿和异戊醇按24：1的比例混合。

8、TE缓冲液(pH8.0)：10mol/L Tris-HCl(pH8.0)；1mmol/L EDAT9、RNase 1mg/ml：称10mg RNase于Eppendorf管中，溶于1ml 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl溶液中，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，此液为10mg/ml RNase浓度，应用时稀释至1mg/ml。

10、70％乙醇、无水乙醇操作1、将含有pBS-SK质粒的大肠杆菌XL1-blue 10μl接种到10ml含氨苄青霉素(100μg /ml)的LB培养液中，37℃振摇过液。

2、取1.5ml菌液转入Eppendorf管中，5000rpm离心1分钟，吸净上清。

3、将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。

4、加200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻缓颠倒Eppendorf管5次，以混合内容物，禁止剧烈振荡。

置冰浴中放置5分钟。

5、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中5分钟。

6、用微量台式高速离心机12000rpm 离心5分钟，将上清转入另一Eppendorf管中。

7、加等体积酚－氯仿，剧烈振荡1分钟后，12000rpm离心5分钟，将上层液转入另一Eppendorf管中。

8、加等体积氯仿－异戊醇，剧烈振荡10秒钟后，短暂离心12000rpm1分钟，将上层液转入另一Eppendorf管中。

9、室温下加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，室温下静置5分钟。

10、12000rpm离心5分钟，去上清液，加1ml 70％乙醇，短暂振摇，然后再离心(12000rpm 分钟)。

11、除去所有上清液，待待残余乙醇挥发干净后，加30μlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，加1μl RNase (1mg/ml)，37℃保温15分钟，取出后即可用于酶切分析或置-20℃保存备用。

实验十四人外周血白细胞DNA制备一、原理从全血制备白细胞DNA，可用非离子去污剂Triton X-100直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，在反应体系中含一定浓度蔗糖，维护核膜内外的渗透压，以防止核膜破裂，通过离心等手段即可获得白细胞的细胞核。