生物化学法
• 即在体外以目的DNA片段为模扳，利用酶学 反应(Klenow酶或Taq酶)，在特异引物的引 导下，合成特异的DNA片段。 • 目前最常用的方法是PCR法。
生物化学法优缺点
优点：合成基因效率高、速度快、特异性好。随着 PCR技术的发展，现在已能合成长达几十kb的DNA 片段。
缺点：产物中可能有1／l0000-l／1000的错配率， 也就是说，PCR产物中可能存在突变体，因此，通 过PCR克隆的基因，必须通过DNA序列测定才能确 认。
复制 双链cDNA
载体 重组DNA分子 受体菌 cDNA碱水解TTTTDNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
4. 聚合酶链反应（PCR）
是一种在体外利用酶促反应大量获
得特异序列的基因组DNA或cDNA的专
门技术，又称为无细胞的分子克隆。
PCR反应的基本原理
第六节 基因定点诱变
基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行 改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随 机突变。 位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸 介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类 是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突 变。 PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有 效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编 码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。
一系列多肽和蛋白质基因，如胰岛素、干扰素和生长激素等 的基因相继被合成，并得到了很好的表达，使得这些原来只 能从动物组织中得到的含量不多的蛋白质能以细菌发酵的办 法大量生产。
核酸的人工合成
概念： 以核苷或单核苷酸为原料并且不依靠任何天然模板或引物，采用有机合成 反应或酶促合成反应进行的寡核苷酸或核酸大分子的合成。
全基因合成
生化合成法的基本战略
化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：
1、小片段粘接法：
根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段
混合退火
T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
全基因合成
2、补钉延长法：
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基
（1）作为合成基因的元件
通过寡核苷酸的合成，能构建出长达2000bp的基因的全序列
（2）作为核苷酸序列分析的引物
寡核苷酸链可以同DNA互补链杂交，因此可作为合成DNA互补链的引物
（3）作为核酸分子杂交的探针
根据蛋白质的氨基酸顺序，反推出基因编码区的可能的DNA核苷酸序列， 并据此合成出寡核苷酸混合物作探针，用以筛选特定基因
cos L 左臂
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
连接反应
体外包装转录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
反复重复以上步骤
化学合成法优缺点
优点：准确性极高，合成速度较快 缺点：合成的寡核苷酸链长度短(不大于80个 碱基)
一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头、 较小基因的合成。 对于超过该法合成范围的寡核苷酸链的合成， 可采用分段合成法。
5. 用寡核苷酸片段组装基因的方法
目前，化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150-200bp， 而绝大多数基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷 酸适当连接组装成完整的基因 用的基因组装方法主要有两种： 第一种方法是将寡聚核苷酸激活，带上必要的5’-磷酸基 团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末 端的双链寡核苷酸片段，再用个大片段。 第二种方法是将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段 彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合 酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链 DNA片段，可经处理插入适当的载体上。
长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
混合退火
Klenow酶聚合
克隆入合适的载体 T4-DNA连接酶连接
全基因合成
3、大片段酶促法：
根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段：
混合退火
Klenow酶聚合 克隆入合适的载体
T4-DNA连接酶连接
全基因合成
上述三种方法各有利弊：
生化合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于生化合 成的份额较大，成本较高； 在大片段酶促法合成目的基因时，虽然生化合成的份额 相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如， 每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单
链大片段的总收率只有7.7%
6. 寡核苷酸化学合成的实际用途
4、氧化作用
利用碘液催化作用，把核苷酸1和2间的3’-5’亚磷酸三酯键氧化为稳定的3’5’ 磷酸三酯键
反复重复以上步骤
DNA固相合成法
DNA 固相 合成 法
4,4'-二甲氧基三苯基
亚磷酰胺
二异丙基胺
DNA固相合成的原理如下：全部反应是按一个不大的固相柱子中进行的。首
先要将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护（封闭）起来，使反应按设 计的方向进行。5‘-OH用二对甲氧三苯甲基 (DMT)保护，碱基上的氨基用
用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸1的5’-OH基团偶联的保护基团 DMT
2、偶联反应
通过弱碱-四唑的催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相载体上的核苷 酸1的暴露5’-OH缩合。
3、封端反应
加入乙酸酐激发的乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的5’-OH基团全 部封闭起来
4、氧化作用
利用碘液催化作用，把核苷酸1和2间的3’-5’亚磷酸三酯键氧化为稳定的3’5’ 磷酸三酯键
第五节 基因的化学合成
1 基因化学合成的概况
随着基因工程的发展，需要定向地修改、设计生物基因组，
快速合成DNA片段的方法显得十分重要。
1957～1965年H.G.科拉纳等人设计并合成了由一种、两种 或 3种脱氧核苷酸组成的重复顺序的脱氧寡核苷酸片段， 并以此为模板用DNA聚合酶和RNA聚合酶进一步复制和转 录，得到了具有对应的互补顺序的长链人工信使核糖核酸 (mRNA)，再用这种人工mRNA在无细胞体系中进行蛋白 质合成。通过分析这样得到的多肽产物的氨基酸顺序和与 模板中核苷酸顺序的对应关系破译了遗传密码。
3 磷酸三酯法
改进的办法之一是采用适当的保护基把磷酸上的OH基团也保 护起来，再进行连接反应。即如图4 所表示的那样，用甲核苷 3′-磷酸二酯（用R5保护磷酸上的OH基团）同乙核苷的5′-羟基 反应生成磷酸三酯型的产物，这个方法称为磷酸三酯法。
4 亚磷酸三酯法
以保护的亚磷酰胺单体为原料，经1H-四氮唑活化后与羟基组分连接， 先生成亚磷酸三酯，再氧化得到磷 酸三酯，称为亚磷酰胺法或亚磷酸 三酯法。
2 磷酸二酯法
基本原理是将一个5’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与 另一个3’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成 一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。
由于以上反应是通过磷酸单酯和羟基缩合生成3′-5′磷酸二酯， 故称为磷酸二酯（合成）法。
能合成长达200bp的寡核苷酸片段 但在磷酸二酯法中，由于产物为磷酸二酯，磷酸上所剩下的 OH基团，虽然化学活性较小,但也能发生反应,因此,当合成的 寡核苷酸链逐渐增长时,由这个磷酸OH基团所带来的副反应也 愈益严重，使合成产率急剧下降，目前这个方法已基本上被 淘汰。
化学合成 以核苷或单核苷酸为原料，完全用有机化学方 法来合成核酸。由于核苷酸是一个多官能团的化合物，因 此,在化学合成中,必须将不希望发生反应的基团保护起来。
酶促合成 通过酶促反应可以把化学合成的小片段连接成 为大片段，或是从已经合成的单链制成双链，它可以加快 合成工作的进展，使人工合成核酸大分子的目标得以顺利 地实现。 大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶是两种经 常使用的DNA连接酶。
（4）用于基因定点诱变研究
体外化学合成一段带有预定突变序列的寡核苷酸片段
（5）作为PCR扩增反应的引物
20个核苷酸左右的PCR寡核苷酸引物
（6）作为重组DNA连接构件
制备重组DNA过程中常用到的连接构件衔接物和接头
DNA合成仪
设计用于合成结构上类似DNA或RNA的寡核苷酸的自动化仪器。 一般应用于固相合成法，每次将一个核苷酸加到所接长的寡核苷酸链上， 加入每一个核苷酸都利用相同的化学反应与相应的嘌呤或嘧啶碱基衍生物 作用。 所用化学反应和操作细节随不同的仪器而改变，最广泛应用的方法是DNA 合成的磷酸酰胺法。
在基因的化学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定序列 结构的寡核苷酸片段，然后再通过DNA连接酶的作用，使他们按 照一定的顺序共价连接起来。 干扰素基因就采用此方法合成。
磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，及在后二者基础上发展 起来的固相合成法和自动化法。
核酸合成包括化学合成和酶促合成两个方面
4 固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸
在磷酸三酯法和亚磷酸三酯法基础上发展起来的固相合成法,其 基本原理是将要合成的寡核苷酸链的3′末端核苷先固定在一个不 溶性的高分子上面，然后再从此末端核苷开始，逐步接长，接 长的链始终被固定在载体上，过量的未反应物和分解产物则通 过过滤或洗涤除去，每接长一个经历一次循环。当整个链的增 长达到所需要的长度后，再将寡核苷酸链从固相载体上切落下 来并脱去保护基，经过分离纯化得到所需要的最后产物。 固相合成不仅可以缩短合成的时间,提高总产率,并且由于每一个 缩合循环都经过同样的操作步骤，因此可以采用自动控制手段。 目前已经设计出多种型号的全自动或半自动的合成机器，其每 一次的连接产率达到97～99％，最快的每轮循环不到10分钟， 最长的合成片段可到100核苷酸以上。