隐失波的渗透深度d12是入射 角及相对折射率的函数。
d12是渗透深度,它等于从分界 面处到光强衰减到分界面处数 值l/ e的处的距离。对于可见 光波长而言，浸透深度约为100 nm。
隐失波存在的实验证明
两块光密媒质做的棱镜中间夹一薄层空气层(光疏媒质)。 如果不断减少空气层的厚度,由于空气层中有透射波,这透 射波进人第二块棱镜。
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Snell定律：
n1>n2
光的反射和折射
Refracted n2 n1
TIR
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当入射角不断增大，透射角为增大 90°时，入射角达 到临界角 θc。依据 Snell 定律得出：
90º
n2
n1
TIR
当入射角继续增大时，光不再透射进水溶液，即发 生了全内反射。
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隐失波
隐失波
NA = n sinθ n sin θ > n sin θc 其中，NA为物镜的数值孔径 ，n， θ分别为物镜的折 射率(浸没油)和孔径角。θc为发生全内反射时的临界角。 物镜的数值孔径越高，则有更多的孔径范围可被利用，且 容易校准光束。
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光学隧道效应
光强度并不发生全反射,而是有隐失波存于介质2中。当 光疏介质薄膜的厚度小于隐失波的渗透深度时,这个波不仅 穿过了光疏介质,而且会促进邻近高折射率介质3中的电子 作受迫振动,由此产生了新的次波,隐失波的形态发生了显 著改变,全反射被破坏,能量发生了流动,导致了光学隧道效 应的产生。
hv H**
收
热
S0
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S1
放
荧
热
光
分子荧光的产生
激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光：10-7-10-9s 磷光：10-4-100s
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电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态）
在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（n, π）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述：
全内反射荧光成像基本原理
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)
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全内反射荧光显微镜(TIRFM)
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目前用于单分子研究的检测技术主要有两大类：扫描 探针显微技术（SPM）和光学技术。其中：
SPM
原子力显微技术（AFM） 扫描隧道显微技术（ STM） 扫描离子电导显微技术（ SICM）
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由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利用 隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光团， 而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了 显微成像的对比度和信噪比。
d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的 距离。
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隐失波强度成指数衰减曲线
但如果处于第一电子激发态最低振动能级的电子 通过无辐射跃迁（系间跨越，intersystem crossing) 改变自旋方向，则因消耗部分能量而降至另一种激 发态：S＝1/2＋1/2＝1，多重度 M＝2S＋1＝21＋1 ＝3，这种电子激发态称为三重态(triplet state)。
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能
Π*
阿克塞尔罗德（Axelrod,Julius) 美国生 物化学家及药理学家。 1970年他与卡茨 冯奥伊勒共享了诺贝尔生理学和医学奖。 于美国卫生研究院度过其大部职业生涯。 他研究药物及激素的作用、神经冲动传 播的化学方面，并特别研究松果体的功 能。
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光反射和折射示意图
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全内反射示意图
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：109—10-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射， 荧光马上会消失。
磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（104—10s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。
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全内反射荧光显微镜结构
目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类 型：棱镜型和物镜型(或无棱镜型)。
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全内反射荧光显微技术，是利用光发生全内反射时产生 的隐失波照明样本，仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团。
与传统的荧光显微镜相比，使显微成像在Z轴上的空间 分辨率得到了显著改善，大大提高了图像的信噪比和对比度。
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全内反射荧光显微成像系统
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分子荧光的产生 当一束特定波长的光照射到物质时，物质分子与光量 子发生“碰撞”。如果这次碰撞时有效的：
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棱镜型
全内反射荧光显微镜结构
物镜型使用高数值孔径(NA≥1．4)的物镜作为荧光信号的接受器， 同时又作为发生全内反射的光学器件，样品的放置非常方便，并且可 与多种技术联用，例如纳米操纵、光镊技术、原子力显微镜等。
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该系统的关键是高数值孔径物镜的使用。由于细胞的 典型折射率为1．33～1．38，因此要实现全内反射，物镜 的NA必须大于1．38，表达式为：
90º
n2
n1
TIR
实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会透过临 界面渗透到水溶液中，平行于界面向水溶液中传播，这一部 分透过的能量场则称之为“隐失波” 或“隐失场”。
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隐失波的频率与入射光线的频率相同，其强度随临界面 的垂直距离呈指数衰减：
其中：Z是离开分界面的距离，I(z)表示距离界面Z处的强 度；I(0)表示临界面处的强度。
M＝2S＋1＝1 电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或－ 1/2，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能级 通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，M=1，成 为单重态。
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当成对电子中的一个被激发到S1、S2等电子能级激 发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电子 成对 。这些能态都被称为单线态或 单重态(singlet state)。
Π*
Π*
量
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Π
S0 单重基态
Π
S1 单重激发态
Π
T1 三重激发态
分子荧光的产生 （雅布隆斯基分子能级图）
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分子荧光的产生
荧光发射：电子由第一激单重态的最低振动能级到基 态，多为S1-S0。由于基态中也有振动弛豫跃迁，这使得发 射荧光的能量比分子吸收的能量要小，所以，荧光的特征 波长比入射波长要长。
光学技术
光学显微镜成像 光学操纵
共聚焦荧光显微技术 （LSCM）
扫描近场光学显微技术 （SNOM）
全内反射荧光显微技术 （TIRFM）
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发展历程 上世纪80 年代，Axelrod 等生物物理学家对 TIRFM 技 术及基本原理进行描述，并探索了其在生物方面的应用。
Axelrod,Julius