(5) 低粘度。
四、高效液相色谱法的主要类型及选择
（－）液一液分配色谱法（LLPC）
流动相和固定相：液体。
样品类型：极性的和非极性的，
水溶性和油溶性的， 离子型的和非离子型的各类化合物。
1．分离原理 原理：液液萃取相同。
2固定相 类型：固定相选择较简单。
例如：强极性β，β′一氧二丙睛， 中等极性的聚乙二醇， 非极性的角鲨烷等。
三维色谱能提供更多全面的信息。
（2）荧光检测法
在HPLC种仅次于紫外检测器。 灵敏度高。 最小 检测限比紫外低一个数量级。 选择性好，优于紫外。 但应用没有紫外广泛。 可以衍生化反应
工作原理
光致发光现象
（3）电化学检测法
利用电化学固有的灵敏度
线性范围106， 高灵敏度 10-12g，可与荧光相比， 具很强的专属性。
但，中断色谱信息，不方便。
e光电二极管陈列紫外检测器
DAD 1976年开始报道 可获得“在流”色谱的全部光谱信息， 即不必停留。可能随色谱峰扫描。 与其他快速扫描检测器相比：
结构简单；工作可靠；性能好。
光路特点
工作原理
核 心 ： 二 极 管 阵 列 元 件 是 一 般 由 200~1024 个 组 成
理论基础
法拉第第一定律 在电介过程中，电极上起反应的物质量
（W）与通过电介池的电量（Q）成正比。
法拉第第二定律 各种不同的电介质溶液中，通过相同的电量
时，电极上析出的电极产物的当量数相同。 （96487库仑）
电化学检测种类
电流检测器 安培检测器，应用最为广泛的一种。 组成：工作电极，参考电极，辅助电极
光波范围：200~600mm 每只分辨率为1~2nm 光点管越多， 分辩率越高 如使用211个二极管陈列元件，最快时10ms可是
成一次测量。 因而每秒可收集20000多个数据 可以得到三维图。
应用
色谱峰纯度检查。 比较光谱法、吸收比法。
色谱峰鉴定 与标准品或标准光谱比较 正常紫外光谱的比较 导数紫外光谱的比较
2．全多孔型固定相
它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。
特性： 这类固定相由于颗粒很细（5～10μm）， 孔较浅，传质快， 易实现高效、高速。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
（二）流动相
正确选择流动相直接影响组分的分离度。
对流动相溶剂的要求是：
（1）溶剂对于样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。 （3）高纯度。 （4）化学稳定性好。
温度、梯度、电解质。
（6）蒸发光散射检测器：ELSD
样品雾化 干燥 细颗粒 激光照射 散射
（7）常用检测器的比较
表
类型 线性
最小检出量 （g/ml）
能否梯度
对流速 对温度
紫外 选
示差 通
2.4×104 104
10-10
10-7
能
不能
不
不
不
敏
荧光 选 103 10-11
能 不 不
安培 选 104 10-9
分离机理
双保留机理，以下共同贡献： 疏溶剂作用 亲硅醇基效应
4.正相键合相色谱法
固定相： 极性的有机基团，CN、NH2等键合在硅胶表面。
流动相： 非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极
性溶剂（如氯仿、醇等）。
流出程序：极性大，后出；极性小，先出。
样品对象： 分离极性化合物。 异构体。 特别适用于分离不同类型的化合物。
3 分离系统——色谱柱
色谱柱:柱管与固定相两部分。 柱管材料:玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光 滑的聚合材料的其他金属。故金属管用得较 多。 柱长5～30cm， 内径为4～5mm（4.6mm,5mm），凝胶色谱柱内径3～12mm，
预柱。
粒度（＜20μm） 填充法:匀浆填充法，
4．检测系统
有两种基本类型的检测器。
不能 敏 敏
ELSD 通 104 1酮提取物标准
银杏总黄酮 银杏总内酯 白果酸
三、高效液相色谱的固定相和流动相
（－）固定相
分类： 以承受高压能力来分类 刚性固体 、硬胶。
刚性固体：以二氧化硅为基质。
硬胶：它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中。
优点：高速、 高效、 高灵敏度、 高自动化。
二、 高效液相色谱仪
主要结构： 高压输液系统， 进样系统， 分离系统 检测系统。
辅助装置： 如梯度淋洗， 自动进样 数据处理等。
1．高压输液系统
部件组成： 储液罐， 高压输液泵（核心）， 过滤器， 压力脉动阻尼器
⑴储液罐
化学惰性
低压脱气法 吹氦脱气法 超声波脱气法
不能用酸、碱度过大或存在氧化剂的溶液作流动相的体系。
（三）液一固吸附色谱法(LSAC)
固定相： 固体吸附剂。
1．分离原理 吸附:
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,
Kad = Kad为吸附平衡常数， Kad值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。 Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。
分离机理
疏溶剂作用理论。
非极性的烷基键合相
“分子毛”，
“分子毛”有较强的疏水特性。
被分离物质分为：非极性部分与极性部分。
一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏 水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；
这种缔合作用是可逆的。
而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相 的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。
一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的 物理或化学特性有响应，属于这类检测器 的有紫外、荧光、电化学检测器等。
另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应，属于这类检测 器的有示差折光，电导检测器等。现将常 用的检测器介绍如下:
（l）紫外检测器
最常用：80%的化合物有紫外吸收 应用最早，最广 灵敏度高 对环境温度及流速波动不敏感 可适用于梯度洗脱
≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20
特性：传质特性好,但易水解且受热不稳 定，仅适用于不含水或醇的流动相。
（2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相 制备反应如下
特性： 共价键健合固定相不易水解， 并且热稳定较硅酸酯好。 缺点是反应不方便； 当使用水溶液时，必须限制PH在4～8范围内。
（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相 制备反应如下：
原理：比尔定律
A、紫外检测器的分类与特点
单波长式 多波长式 紫外/可见分光式 光电二极管阵列快速扫描式
a单波长紫外检测器
1如紫外—254检测器 光源： 低压录灯 254nm 80~85% 检测池：样品池小于10ul
光路长：10mm 参比池：空气 光电接收元件：光电倍增管
光电管 光敏电阻
b多波长紫外检测器
光路：与单波长紫外吸收检测器一致， 但：光源是氘灯或氢灯
波长：200~400nm， 灵敏度：比254nm紫外检测器要低。
c紫外—可见分光式检测器
是装有流通池的紫外—可见分光光度计， 光源：氘灯和钨灯
d扫描型可变波长紫外检测器
在色谱流停止工作的情况下，记录样品池 中洗脱组分的吸收行为，
既可提供色谱图，又可提供光谱图；既可 定量，又可定性分析。
1．键合固定相类型
载体： 硅胶。 (Si一OH)与有机分可成键, 一般可分三类
（1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等
（2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。
（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐； 作为阳离子交换 基团的磺酸等.
2．键合固定相的制备
（l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相。 用醇与硅醇基发生酯化反应：
流失问题： 化学键合固定相。 重大突破。应用最广泛。 3/4以上的分离是在化学键合固定 相上进行的。
3．流动相 基本要求：
尽可能不与固定相互溶， 流动相与固定相的极性差别越显著越好
正相分配色谱：
流动相的极性小于固定相的极性， 它适用于极性化合物的分离。 极性小的先流出，极性大的后流出。
反相分配色谱：
第四章 高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
一、概述 20世纪60年代末70年代初
理论：气相色谱的理论 技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器
因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自 动化的特点。
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
氧化铝 （ε0硅胶=0·77×ε0氧化铝）。
(四）离子交换色谱法（IEC）
离子交换原理和液相色谱技术的结合
样品对象： 离子型化合物 如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。 因此，应用范围较广。
1．离子交换原理
待测离子对固定相（离子交换树脂）亲和力的差别来实现分离的。
阳离子交换：
阴离子交换：
一般形式： R一A＋B ＝ R－B＋A
⑵高压输液泵
、①要求： 流量稳定，无脉动 输出压力高 流量范围宽 耐酸，碱缓冲液腐蚀 泵体易于清洗：具有梯度洗脱功能，
②高压输液泵的分类
液压隔膜泵 气动放大泵 注射泵 往复柱塞泵
A、液压隔膜泵
B、气动放大泵
C、注射泵
D、往复柱塞泵
往复泵的优点： 液缸容积小，易于情况，更换系统，
特别适合于梯度淋洗，广泛应用于 HPLC，但：有脉动，
达平衡时，平衡常数（离子交换反应的选 择系数）：
KB/A = [A][B]r/[B][A]r，
D、往复柱塞泵
克服脉动办法： ①采用多头泵交替联动 ②压力脉动阻滞器 ③改进驱动凸轮的几何形状
WATERS泵的特点、泵体、脉动阻滞器、 驱动凸轮。
⑶梯度洗脱装量