R : 一般为同源二聚体, 反向结合 作用在两条链
M: 单体
DNA同时切割, M只作用新链
type IIs 占5%
识别位点非对称, 非间断 4-7bp 切割位点可能在20bp范围内。 R: 与 type II 具有相同的辅助因子要求 M: 通常由两个M来完成,各作用一条链
(2) type I 和 typeIII
R-M+突变 SM-
phenotype
M+ R- MR- M- 保全机制
识别位点
EcoB T°GA*(N)8ATG* CT
°
EcoK AAC (N6)GTGC A
* 甲基化位点
°可能的甲基化位点
切割位点1000bp以外, 无特异性
typeIII (<1%) EcoP1 EcoP15
识别 AGACC CAGCAG 切割 下游 24-26bp处
EOP=1
E.coli K
K 1 B 10-4 C 10-4
E.coli B
10-4 1
10-4
E.coli C
1 1 1
说明K和B菌株中存在一种限制系统 可排除外来的DNA 10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果
甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5‘甲基胞嘧啶
2. 限制酶的发现
60年代，限制内切酶和限制酶的概念
type I (1%) 种类少 如 EcoR EcoB
R酶和M酶 各作为一个亚基存在于酶分子中
即R基和M亚基，还有负责识别DNA序列的S亚基 分别由hsdR，hsd M，hsdS基因编码 属于同一操纵子（转录单位）
EcoK EcoB
R2M2S R2M4S2
P1—hsdR—P2—hsdM—hsdS
Gene type
１. Molecular Cloning V2.0, 1989 分子克隆实验指南
2. 基因工程原理 第二版（上册） 吴乃虎 科学出版社 1998/2000
3. 分子生物学试剂产品目录 如 New England BioLabs
其它 基因及其操作原理
精编分子生物学实验指南
Internet
二、基因的基本概念
1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶
需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点达离识别位点1000bp以上
1970年 美国约翰·霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 无细胞提取液可降解E.coli DNA 但不能降解自身DNA
▪ 利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段 的能力使得纯化那些DNA片段成为可能
▪ 获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中 的基本介质
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制 免疫系统 细菌的限制与修饰系统
限制性内切酶 修饰酶
一、限制与修饰 Restriction and modification
三、基因克隆的通用策略
Chromosome DNA
...GAATTC... EcoRI ...CTTAAG...
...G ...CTTAA
AATTC... G...
Target gene
酶切 连接
酶切
vector
转化
筛选
Recombinant plasmids
第二章 工具酶
▪ 切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的 标记
• 宿主 属名第一字母、种名头两个字母
• 菌株或型号
• 序号 罗马字
HindII EcoRI
早前 加R, or M 菌株号和序号小写
1986年下半年 发现 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌
3000种酶 200多特异性
3. 限制与修饰系统的种类
亚单位组成, 识别序列的种类, 是否需要辅助因子
互斥
同时竞争
限制反应是
否需要 ATP
No
Yes
Yes
(3) I-prefix 和 PI-prefix 是否为R/M系统中的一个成员?
II
I
III
酶分子
内切酶与甲基化 三亚基双功能 二 亚 基 双
酶分子不在一起 酶
功能酶
识别位点
4-6bp 大 多 数 为回文对称结构
二分非对称
5-7bp 非对称
切割位点
在识别位点中或 靠近识别位点
无特异性 至少在识别位 点外 1000bp
在识别位 点下游 2426bp
限制反应与 甲基化反应
分开的反应
50年代初，发现 host controlled specificity 噬菌体具有代表性和普遍性 其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主 后，再去感染其它宿主时4
E. coli K
EOP=1
EOP=1
E. coli C
pfu plaque forming unit EOP Efficiency of plate
绪论
一、什么是基因操作
• 将在细胞外产生的核酸分子 • 插入病毒质粒或其它载体系统中 • 再整合到那些本来不含该类物质的宿主中 • 从而形成一种新的可连续繁殖的有机体
目的
要求掌握 • 基因操作中基本的普遍应用的原理 • 并能自主设计通用操作方法和策略
要求的基础
生物学 生物化学 分子生物学
参考书籍
１．基因及其产物的共线性 ２．基因及其产物的非共线性
３．基因的重叠与可变性
三、基因的基本结构组成
• 编码区 ORF • 启动子 promoter • RBS ribosomal binding site • 终止区 terminator • flanking sequence
upstream / downstream • Cap/tail
即HindII酶
5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
GTCGAC G T TAA C G T C AA C GTTGAC
YR
5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’
EcoRI
3. 限制酶的命名
分三类(I, II ,III) 也有分四类，IIs类，即II 亚类
(1) type II 93%
识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 3’-OH,5’-P，
需Mg2+，相应的修饰酶需only SAM
识别序列主要为4-6bp， 或更长且呈二重对称的特殊序列
但有少数酶识别更长的序列或简并序列 切割位置因酶而异，有些是隔开的