文章编号:1000-2375(2006)04-0403-04大黄蒽醌类化合物电喷雾质谱研究马小红,沈少林,韩凤梅,陈　勇(湖北大学中药生物技术湖北省重点实验室,湖北武汉430062)摘　要:采用电喷雾-离子阱质谱(E SI -ITMS )法,通过一级质谱全扫描和二级质谱碰撞诱导解离技术,研究5种大黄蒽醌衍生物(大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚)的质谱行为及分子结构与裂解规律间的关系,并对大黄药材中总游离蒽醌提取物进行了电喷雾质谱检测.实验结果显示,5种大黄蒽醌类化合物一级质谱负离子出峰较好,被测样品均为基峰或第二强峰,未发现聚合体离子及加合离子产生,二级质谱各碎片离子归属明确,特征性强.实验结果可应用于大黄蒽醌类化合物的结构分析及进一步的代谢产物研究,并为大黄药材有效成分的鉴定提供了一种快速,灵敏的检测方法.关键词:大黄;蒽醌;电喷雾质谱;特征图谱中图分类号:O657.63;Q946.88 文献标志码:A收稿日期:2006-04-13基金项目:科技部攻关项目(2001BA701A01)和湖北省杰出青年基金项目(2002AC004)资助作者简介:马小红(1968-　),女,实验师;陈勇,通讯作者大黄(Radix et rhizoma rhei )为蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L )、唐古特大黄(Rheumtanguticum Maxim .)或药用大黄(Rheum officinale Baill )的干燥根及根茎[1],其主要药效成分为1,8-二羟基蒽醌类衍生物,包括大黄素(emodin )、大黄酚(chr ysophanol )、大黄酸(r hein )、大黄素甲醚(physcion )、芦荟大黄素(aloe -emodin )等.这类物质及其甙类具有泻下、抗菌、抗癌等多种生理活性,临床应用非常广泛[2].对于大黄蒽醌类物质的分离、含量测定、药理研究等一直是一个非常活跃的领域,多见文献报道[3,4].但迄今为止,还少见大黄蒽醌类化合物电喷雾离子阱质谱(ESI -ITMS )电离规律方面的研究报道.电喷雾质谱离子化条件温和、谱图简单,特别适用于极性和热不稳定的天然化合物的分析,其一级质谱主要产生准分子离子峰,而多级质谱能提供化合物的结构信息,是研究分子结构的灵敏、快捷和有效的现代分析方法[5～8].本文中应用E SI -ITMS 技术研究并探讨了5种大黄蒽醌衍生物一级质谱行为规律及二级质谱裂解规律,分析了该类化合物分子结构与其质谱裂解规律之间的关系,并对大黄药材总蒽醌提取物进行了电喷雾质谱检测.研究结果为该类化合物的结构分析提供了理论依据,同时也为大黄药材有效成分鉴定提供了一种快速、灵敏的检测方法.1　实验1.1　仪器和试剂　Finnigan LCQ Duo 型质谱仪(包括电喷雾电离(ESI )源,TSP P4000泵,TSP AS3000自动进样器,Xcalibur 数据分析软件1.10版),宁波新芝JY92-Ⅱ超声波细胞破碎仪,大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酚对照品和大黄对照药材均购自中国药品生物制品检定所,Fisher 公司色谱纯甲醇,超纯水,其他试剂为国产分析纯.1.2　质谱条件　ESI 离子源喷雾电压:4.5kV ;毛细管温度:200℃;毛细管电压:45V ;鞘气(N 2)流速:40个单位;流动相:甲醇∶0.01mol ·L -1乙酸铵水溶液(50∶50V /V );流速:0.20mL ·min-1;正、负离子一级质谱全扫描及二级质谱全扫描分析.1.3　样品制备　分别准确称取大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酚配制成1.0g /L 甲醇储备液,进样分析前用甲醇稀释5倍后直接进样.准确称取0.50g 大黄药材粉末,置100mL 离心管中,加20mL 甲醇浸泡30min 后,超声提取30min ,功率300W .药材提取液经浓缩后用乙醚萃取,乙醚萃取第28卷第4期2006年12月湖北大学学报(自然科学版)Journal of Hubei University (Natural Science )　Vol .28　No .4　Dec .,2006液用氮气挥干后,加20mL 甲醇溶解,供质谱分析.2　结果与讨论2.1　对照品一级全扫描质谱分析　按实验方法进行大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酚对照品的一级质谱分析.由于大黄蒽醌类化合物在电喷雾电离条件下容易失去H +而带负电荷,因此其负离子检测结果(图1a ～5a )优于正离子检测结果.在该类化合物分子中,酚羟基上的O 原子和苯环间存在p -π共轭,降低了O 原子上电子云的密度,增大了H +电离趋势,因而所失去的H +应来自于苯环上的羟基.2.2　对照品二级质谱分析　大黄素(emodin ):大黄素对照品的二级质谱见图1(1b ).该图谱简单,碎片易归属.m /z 269为少量未被打碎的大黄素负离子质谱准分子离子峰[M -H ]-;m /z 241是大黄素分子失去中性分子C O 后的碎片[M -H -C O ]-;m /z 225为m /z 241再失去一个氧原子产生的碎片.芦荟大黄素(aloe -emodin ):芦荟大黄素对照品的二级质谱见图1(2b ).该图谱碎片离子较少.分子离子失去中性分子C O 及一氧原子得到m /z 225[M -H -C O -O ]-;m /z 223为分子离子失去H 2O 和C O 的产物[M -H -C O -H 2O ]-;而基峰m /z 240,推测为分子离子失去CO 后,再失去一个氢原子后所得,即m /z 240[M -H -CO -H ]-.大黄酸(rhein ):大黄酸的二级质谱见图1(3b ).m /z 257为准分子离子失去一羰基CO 后,相邻两C 原子各结合一氢H 后的碎片[M -H -CO +2H ]+,m /z 239为分子离子失去一分子C O 2的产物[M -H -CO 2]-.图1　大黄素(1),芦荟大黄素(2),大黄酸(3),大黄素甲醚(4),大黄酚(5)一级和二级质谱全扫描图a .一级质谱;b .二级质谱大黄素甲醚(physcion ):大黄素甲醚对照品一级全扫描质谱中除了该化合物的准分子离子峰[M -H ]-m /z 283,还有另一质谱峰m /z 269.后者的二级质谱和大黄素的二级质谱图十分吻合,说明大黄素甲醚对照品中存在大黄素.大黄素甲醚的二级质谱见图1(4b ).m /z 268为准分子离子失去·CH 3后的碎片[M -H -CH 3]-.m /z 240为m /z 268再失去一羰基C O 后的碎片[M -H -CH 3-CO ]-.大黄酚(chrysophanol ):大黄酚二级质谱图见图1(5b ).其中m /z 239为准分子离子失去一CH 2后的碎片[M -H -CH 2]-;m /z 225为准分子离子失去中性C O 产生的碎片[M -H -CO ]-.同时在大黄酚一级质谱图中还存在另一质谱峰m /z269,将其进行二级质谱分析,结果其二级质谱图与大黄素的二级质谱图404湖北大学学报(自然科学版)第28卷图2　大黄蒽醌类化合物电喷雾质谱裂解部位十分吻合,说明大黄酚对照品中存在大黄素.由上述实验结果可见,大黄蒽醌类化合物分子的共轭体系结构决定了其分子较稳定,二级质谱碎片较少.其电喷雾质谱选择性离子碰撞诱导解离(CID )中,失去母核基团中的CO但留存共轭体系是主要裂解方式;其次,侧链R 1,R 2也是较活跃的裂解部位,侧链取代基(主要为羟基,甲基,甲氧基,羧基等)容易以O 、H 20、C H 4,C H 2CO 2等中性小分(原)子片断的形式离去(图2).2.3　对照药材电喷雾质谱分析　在相同质谱条件下,对大黄药材总游离蒽醌提取物分别进行一级质谱全扫描和选择性离子碰撞诱导解离二级质谱分析得到图3.大黄药材总游离蒽醌提取物的一级质谱全扫描图见图3(7a ),从中可以很清楚看到出现了m /z 253.4、269.3、283.13个最强峰,这和5种对照品一级质谱图中出现的分子离子峰完全符合.将这3个最强峰m /z 253、269、283分别进行二级质谱分析,得到图3(7b ～7d ).图3(7b )为m /z 283的二级质谱图,得到的碎片峰中同时出现了m /z 239、m /z 240、m /z图3　大黄药材总游离蒽醌提取物一级和二级质谱全扫描图(负离子)7a .一级质谱　7b .m /z283的二级质谱　7c .m /z269的二级质谱　7d .m /z253的二级质谱257和m /z 268.由于大黄酸和大黄素甲醚的分子离子峰均为283,而提取物m /z 283二级质谱碎片峰恰好是这两者碎片峰的加合,因此可确定提取物中同时含有大黄酸和大黄素甲醚.同理,图3(7c )为m /z 269的二级质谱图,得到的碎片峰也是大黄素和芦荟大黄素二级碎片峰的加合,因此可知提取物中同时含有大黄素和芦荟大黄素.而图3(7d )为m /z 253二级质谱图,主要碎片离子和大黄酚非常吻合,故可确定为大黄酚.将上述大黄总游离蒽醌提取物的一、二级质谱图同时进行比较,可快速确定大黄提取液中所含蒽醌类物质种类,适宜作为大黄药材有效成分特征图谱.参考文献:[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[M ].北京:化学工业出版社,2000:19.[2]郑虎占,董泽宏,佘靖.中药现代研究与应用(第二卷)[M ].北京:学苑出版社,1997:382-383.[3]杨云,冯卫生.中药化学成分提取分离手册[M ].北京:中医药出版社,1998:18-19.[4]王尔康.21世纪的分析化学[M ].北京:科学出版社,1999:112-116.[5]应万涛,钱小红.生物质谱应用及进展[J ].军事医学科学院院刊,2000,24(2):146-150.[6]丛浦珠.质谱学在天然有机化学中的应用[M ].北京:科学出版社,1987:78-79.[7]Pierluigi Mauri ,Piergiorgio Pietta .Electrospray characterization of selected medicinal plant extracts [J ].Journal of Pharmaceuticaland Biomedical Analysis ,2000,23:61-68.[8]Antti Leinonen ,Tiia Kuuranne ,Risto Kostiainen .Optimization and comparis on of three ionization techniques [J ].Journal of M ass Spectrometry ,2002,37:693-698.405第4期马小红等:大黄蒽醌类化合物电喷雾质谱研究406湖北大学学报(自然科学版)第28卷The electrospray ionization-mass spectra of Radix et rhizoma rheianthraquinonesMA Xiao-hong,SHEN Shao-lin,H AN Feng-mei,CHEN Yong(Hubei Province Key Lab of Bio-Technology of Traditional Chinese Medicine,Hubei University,Wuhan430062,China)A bstract:Five anthraquinones(Emodin,Chr ysophanol,Rheni,Physcion,Aloe-emodin)in Radix et rhizoma rhei were analysed by E SI-ITMS detector to study their relationship between molecular structure and MS behavior,and Radix et rhizoma rhei extract of anthraquinones was also detected in MS full scan mode and CID MS2 mode.The results showed that these five anthraquinones were easily to lose H+and become negative ions,the semi -molecular ions of the anthraquinones were base peaks or second strong peaks in MS spectra,no polymerized ions were found.In CID mode detection,the MS2spectra is of high specificity and the assignments of fragmentation of the five anthraquinones were clearly analysed.This characteristic anthraquinones mass specctra will be helpful refer-ence for further study on their molecular struture analysis and metabolite substance detection,and it also offer a rapid,sensitive method for identification of medicinal plant Radix et rhizoma rhei.Key words:Radix et rhizoma rhei;anthraquinones;ESI-MS;fingerprint(责任编辑　游　俊)(上接第396页)[12]汪松,解焱.中国物种红色名录[M].北京:高等教育出版社,2004:380-397.[13]国家环保局,中国科学院植物研究所.中国珍稀濒危保护植物名录[M].北京:科学出版社,1987,52-54.[14]吴征镒.中国植物属的分布区类型[J].云南植物研究,1993,IV(增刊):1-135.[15]董世林.植物资源学[M].哈尔滨:东北林业大学出版社,1994.147-148.[16]周繇.乌苏里虎凤蝶临江亚种的生态习性[J].昆虫知识,2002,39(4):307-309.[17]周繇,朱俊义.中国长白山蝶类彩色图志[M].长春:吉林教育出版社,2003:27-32.[18]苏志尧,吴大荣,陈北光.广东山茶科稀有濒危植物的区系特点和保护评价[J].华南农业大学学报,2000,21(2):34-37.Floristic and conservational analysis ofrare and endangered Ericaceaes plants in C hangbai MountainsZH OU You(Depart ment of Biology,Tonghua Teacher's College,Tonghua134002,China)A bstract:After three years of investigation,the results of investigation are reported.There are5genuses,14 species of rare and endangered ericaceae plants in all together in Changbai Mountains.Some pr oposals for protecting the resources of these plants are presented on the base of floristic characteristics,distribution,endangered causes, conservational value and present conditions of natural pr otection.It provides source material for further studying the rare and endangered ericaceae plants in Changbai Mountains.Key words:Ericaceae;rare and endangered plants;c onservation;Changbai Mountains(责任编辑　游　俊)。