植物组织培养实验及实习指导杨玲编西南林学院生物技术教研室目录实验一、母液的配制和保存 (2)实验二、培养基的配制与灭菌 (5)实验三、外植体消毒与初代培养的建立 (7)实验四、继代与增殖培养 (9)实验五、生根培养 (1)1实验六、植物茎尖脱毒培养 (1)3实习试管苗的炼苗与移栽 (1)5实验一、母液的配制和保存一、实验目的通过配制MS培养基母液，掌握贮备液的配制和保存方法。

二、原理配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存。

使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。

以MS培养基为例，所需配制的母液为：大量元素母液（母液Ⅰ，浓缩20倍）、微量元素母液（母液Ⅱ，浓缩200倍）、铁盐母液（母液Ⅲ，浓缩200倍）和有机化合物母液（母液Ⅳ，浓缩200倍）等。

三、实验材料、试剂和仪器设备1．试剂NH4NO3, KNO3, CaCl2·2H2O, MgSO4·7H2O, KH2PO4, KI, H2BO3， MnSO4·4H2O, ZnSO4·7H2O, Na2·MoO4·2H2O, CuSO4·5H2O, CoCl2·6H2O, Na2•EDTA•2H 2O，FeSO4·7H2O，烟酸，甘氨酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇, 蒸馏水2．仪器设备冰箱，天平，酸度计或pH试纸，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1 000ml，100ml，25ml)，容量瓶(1000ml，500ml，100ml)，磨口试剂瓶(500ml，1 000ml)，药勺、称量纸、酸度计或pH试纸，滴管、玻璃棒，电炉，微波炉四、实验方法1.大量元素母液的配制配制时先用量筒量取蒸馏水大约800ml，放入1000ml的烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3,KNO3,KH2PO4,MgSO4.7H2O ,CaCl2.2H2O，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入1 000ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，然后，倒入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

2.微量元素母液的配制按照配方表中用量用电子天平分别依次称取MnSO4•4H2O， ZnSO4•7H2O ，H2BO3，KI ，NaMoO4•2H2O， CuSO4•5H2O， CoCl2•6H2O，按制备母液Ⅰ的方法逐个溶解。

（钼酸钠难溶解，可在室温下用蒸馏水溶解后再加入到微量元素母液中。

）定容至1000ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

3.铁盐母液配制把FeSO4•7H2O和 Na2•EDTA•2H2O分别置于450ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解。

保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2•EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后把pH值调到5.5，加蒸馏水到最终容积1000ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。

在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4℃冰箱中保存备用。

4.有机化合物母液的配制按配方表中用量依次称取：维生素B1，烟酸，甘氨酸，维生素B6，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

5.植物生长物质母液的配制NAA母液：准确称量10mg，先用少量1mol/LNaOH溶液完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为0.1mg/ml的NAA母液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

6-BA母液的配制方法相似，母液浓度为2mg/ml。

请注意细胞分裂素的溶解方法。

五、实验报告按照实验报告格式要求及各组在实验中的配制溶液情况，完成报告撰写。

附：MS培养基母液配方实验二、培养基的配制与灭菌一、实验目的学习用母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法。

二、原理组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。

三、实验材料、试剂和仪器设备1．试剂琼脂，蔗糖，蒸馏水，NAA，6-BA，1mol/LHCl，1mol/LNaOH2．仪器设备天平，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，移液管（10ml，5ml，2ml，1ml，0.5ml），药勺，称量纸，玻璃棒，吸耳球，滴瓶，酸度计或pH试纸，培养瓶，封口膜，耐热橡皮筋，线绳，高压灭菌锅，微波炉，电炉，标签纸，记号笔四、实验步骤1.培养基的配制培养基组成：MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂(pH5.8)①将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。

本实验需配制的培养基所需吸取的各种母液的用量如表1所示：②取50ml烧杯一个，用量筒量取大量元素母液，然后用各母液专用移液管分别吸取微量元素母液，有机母液、铁盐母液和生长物质母液，置于烧杯中备用。

③取500ml烧杯一个，加入300ml蒸馏水，称量琼脂4g倒入烧杯中，将烧杯置于电炉上或微波炉内加热，待琼脂完全溶化后，加入15g蔗糖，充分溶解后，将准备好的大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素母液混合液倒入烧杯中，用蒸馏水将装过母液混合液的烧杯洗三遍，一并倒入500ml烧杯中，并加蒸馏水定容。

④充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为5.8。

⑤把培养基分装到广口瓶中，每瓶约50ml。

用封口膜封好瓶口。

贴上标签，注明培养基名称，配制者姓名和配制日期，待灭菌。

2.培养基灭菌（灭菌条件：121℃，15分钟）①检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。

把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。

②盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。

③灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。

④刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。

放置在水平桌面上自然冷却。

在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。

经检查没有杂菌生长的方可使用。

要求：每人准备培养基2瓶。

提前准备实验三所需的无菌材料。

五、实验报告附：稀酸和稀碱的配制方法1mol/LHCl取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至100ml，即为1mol/LHCl。

1mol/LNaOH称取氢氧化钠4g，加入蒸馏水100ml，即为1mol/LNaOH。

实验三、外植体的消毒与初代培养的建立一、实验目的通过实验，初步掌握外植体材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体初代培养的方法。

二、原理植物组织培养是在无菌条件下对离体的植物器官或组织的培养。

而植株各部分的表面携带着各种不同的微生物，所以在接种前就必须选择合适的消毒剂对外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。

离体器官或组织受到适当刺激，便可进行器官分化，从而实现细胞的全能性。

三、实验材料、试剂和仪器设备1．实验材料：月季当年生枝条2．试剂：升汞，吐温-803.仪器设备（以各组所需为例）无菌器材：8瓶培养基4个不锈钢托碟+吸水纸1升无菌水大号、中号镊子各2把2把解剖刀、1把剪刀2个500ml烧杯非无菌材料：0.1%升汞消毒液200ml1个250ml消毒缸2盏酒精灯及火机1个1000ml搪瓷缸 (装废液用)1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球1把大号镊子、1把枝剪、1把解剖刀、1把旧牙刷橡皮筋若干、标签纸、记号笔、洗衣粉、毛巾、洗衣粉、喷雾器、鞋套、肥皂四、实验步骤1．实验二制备的培养基即是本实验所用培养基。

2．接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台。

房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯及房间的紫外灯，照射约30mins；然后关闭紫外灯，打开房间换气扇以及超净工作台的风机，并微启超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作。

3．选取生长健壮的枝条，用饱满又未萌发的侧芽作为外植体（取中部的芽较好）。

将外植体用手术刀切去叶片，并剥去附在茎上的叶柄及皮刺，用毛刷沾洗衣粉刷洗并在自来水下冲洗干净。

吸干水份后切成约2-3cm的茎段，每段至少有1个侧芽。

将处理好的外植体转入洁净的消毒缸中，用加了数滴吐温-80的0.1%的升汞溶液浸泡10min。

在表面灭菌过程，应不停摇动消毒缸使消毒液与外植体充分接触。

3．准备进入接种间，用肥皂水清洗双手至手肘部位并在自来水下冲洗干净，进入缓冲室后套上鞋套。

4．把浸泡在消毒液中的外植体转移到超净工作台中。

消毒时间结束后在酒精灯火焰旁用无菌镊子将已完成表面灭菌的外植体转移到烧杯中，用无菌水清洗5次，每次不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒剂。

最后一次清洗后将外植体转移到无菌托碟上，吸干水分备用。

5．将消毒后的外植体按极性方向接种到培养基上，每瓶可接入3～4段月季茎段。

将培养瓶放置在21±2℃，光强800～1200lx，光周期为12h的环境下培养。

约30天长成具5～8片叶的无根试管苗。

6．各组的每位同学操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中，由下一位同学在使用前灭菌。

方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。

五、实验报告1.接种2天后观察污染情况，计算污染率。

污染率=污染的材料数/总接种材料数×100%2.每周观察并记录外植体萌动的情况，包括外植体基部是否有愈伤组织出现及其出现时间，侧芽萌发时间及芽的生长状况（萌芽数及芽平均长度）等，并计算萌发率。

并注意观察是否有芽玻璃化等异常情况出现。

萌发率=侧芽萌发的茎段数/总接种材料数×100%六、思考题为什么常在消毒液中加入1～2滴表面活性剂如吐温-80？实验四、继代与增殖培养一、实验目的通过实验，掌握运用植物生长调节物质调控植物器官分化的方法。

二、原理以植物的茎、叶等作为外植体进行离体培养，可以直接诱导器官分化，产生芽、根，形成新的植物体；也可以诱导其改变原来的分化状态脱分化形成愈伤组织。