植物分子生物学实验技术
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主要内容
第一部分 核酸的分离制备 第二部分 PCR技术 第三部分 主要分子标记 第四部分 基因克隆
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参考书目：
（美）Dveksler GS and Dieffenbach CW. 黄培堂 俞炜源 陈添弥等译 现代生物技术译从 PCR技术实验指南 科学出版社
（英） Clark MS 主编 顾红雅 瞿礼佳 主译 植物分子生物学实验手册 高等教育出版社 施普林格出版社
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4. 基本步骤
（6） DNA纯度和浓度检测 0.8%琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计检测 琼脂糖凝胶电泳法(常用） DNA样品在紫外线照射下发出的红色荧光强度与DNA的含量成正比 使用标准浓度的DNA样品作对照，可以估计出被测DNA的浓度 紫外分光光度计检测 DNA在260nm处有一个明显的吸收峰估计浓度 在A260 1OD相当于双链DNA浓度50 µ g/mL 根据A260/A280比值估计DNA纯度 纯DNA 的A260/A280=1.8±0.1， RNA的比值为2.0左右。 >1.8 <1.8 可能有RNA未除去 可能有酚和蛋白质之类的杂质
现代分子生物学的发展导致DNA 分离技术层出不穷, DNA 已经可以 从诸如化石、标本、木乃伊等极端材料中分离出来, 也可以从痕量材料获 得DNA
无论什么材料, 针对不同来源和特点, 调整设计相应的提取缓冲液及 不同的技术方案是十分重要和必需的
在实际应用中可针对不同情况对具体实验方案的各个部分进行不同 组合。缓冲液的成分应根据分离对象的不同而变化，缓冲液的pH值、保 护剂和表面活性剂都要根据不同样品进行优化
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7. DNA提取过程中各试剂的主要作用
β巯基乙醇和抗坏血酸钠：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 使酚类物质容易从基因组DNA去除
蛋白酶K:是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸 的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的一般降解。将蛋白质降解成小肽 或氨基酸，使DNA分子分离出来
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3. 基本原理
(1) 破坏（消化）细胞壁、释放内容物
在破壁时也会剪切DNA，在完整性和产量间折衷考虑 分离总DNA破壁方法 液氮中快速冷冻、研磨成细粉末
分离核DNA或细胞器DNA破壁方法
更温和的方法、以免过早破坏内膜系统、含渗透剂的缓冲液4oC匀浆 (2) 破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中 通常靠SDS或CTAB去污剂来完成，保护DNA受核酸内源酶降解 缓冲液通常含EDTA，可螯合大多数核酸酶所需要的辅助因子-镁离子
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7. DNA提取过程中各试剂的主要作用
苯酚/氯仿： （1）苯酚/氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时， 蛋白质分子之间的水分子就被挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心， 变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而 与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层
样品长期保存
液氮处理后贮存在- 80℃冰箱或直接储放于液氮中
在与提取缓冲液接触前防止冰冻样品在空气中融化导致酚类易被氧化 实验室发苗、田间取叶片（清洗去除灰尘、泥土以及菌孢子等） 饥饿处理减少淀粉含量、遮光处理产生黄化苗
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4. 基本步骤
（2）组织（细胞）破碎 物理方法 溶涨和自溶; 化学方法 生物酶降解 液氮快速冷冻处理后研磨（推荐）或在提取缓冲液中研磨（不推荐） （3）释放DNA 释放DNA到CTAB或SDS类去污剂中、65oC保温处理 （4）纯化和浓缩：去除残渣、沉淀DNA 释放出的DNA中含有大量的RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质 需用氯仿、苯酚处理后变性、沉淀除去，RNA可用RNase除去。 通常采用4oC离心的方法，产生分层，去掉植物残渣、留上清液部分 沉淀通常采用异丙醇（1 volume)、酒精（2 volume) 等 （5）洗涤 去掉部分色素和盐等，通常采用70%酒精和100%无水乙醇
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5. 提取缓冲液对植物总DNA提取的影响与作用
表面表面活性剂： 十二烷基磺酸钠(SDS)： 是一种阳离子强表面活性剂, 通常与蛋白酶K和抗氧化剂、 螯合剂一起使用 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) ：是一种在高盐下能与核酸结合形成可溶、稳定的 复合物, 低盐浓度下可沉淀的表面活性剂 酶抑制剂 乙二胺四乙酸 (EDTA)： 可用于抑制金属离子依赖性的酶 (螯合Mg2+ 、Ca2+ ) 的活 性 牛血清白蛋白(BSA) ：可使一些降解酶的表面变性 精胺及其他多胺: 降低核酸酶的影响 氰化物: 降低重金属氧化酶的影响
(9) 调节取样时期可减少粗提产品中多糖含量，生长幼苗暗室暗化处理，黄化 叶提取DNA可有效地防止多糖污染
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6. DNA提取过程中杂质去除
植物色素成分去除
植物色素分布：在植物中广泛存在 种类：脂溶性和水溶性色素两类 脂溶性色素多为四萜类衍生物 不溶于水，难溶于甲醇，易溶于乙醇、乙醚和氯仿等 叶绿素、叶黄素、胡萝卜素、番红花素和辣椒红素等 其中胡萝卜素不溶于乙醇。 水溶性色素：主要为花色甙类，又称花青素，普遍存在于花中 可溶于水与乙醇，不溶于乙醚与氯仿等有机溶剂，色泽随pH改变
可以采用非可溶性PVP（polyvinylpyrrolidone）研磨样品， PVP能络合多酚类物 质，不但能较彻底防止氧化作用，而且能有效的去除多糖和色素 在DNA浓缩之前，再用CTAB处理1-2次；或采用乙醇等有机溶剂洗涤 加入抗氧化剂，防止酚类物质褐化
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7. DNA提取过程中各试剂的主要作用
（2）多糖、单宁等物质与DNA 会结合成粘稠的胶状物,获得的DNA 常出现产 量低、质量差、易降解，影响了DNA 质量和纯度，不能被限制性内切酶 酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR 扩增
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2. 提取DNA应满足的基本原则
不同的研究对DNA的要求不一致，但一般应满足: (1) 排除蛋白、糖类和脂类等物质的污染，DNA纯度应满足下游操作需要 用于RFLP、AFLP应满足酶切要求 用于PCR的不含PCR的干扰甚至抑制物 (2) 所得DNA应当完整 电泳检测得到清晰、完整、可重复、无降解的条带 保证DNA一级结构的完整 (3) 足够量的DNA 有的实验要求量多（标记）
液氮：组织破碎、裂解细胞 EDTA，Tris/HCl: 缓冲体系使溶液pH不会变化太大，DNA在这一体系中呈稳定 态，EDTA螯合Mg 2+或Mn 2+离子，抑制DNase的活性，防止DNA被DNase降解 异丙醇/酒精：沉淀DNA；DNA溶于水，不溶于酒精，在用乙醇沉淀DNA时常加 入单价的阳离子NaCl 或 NaCH3COOH，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀 RNase: 消化RNA。 PVP （polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮): 抗氧化作用，络合酚类物质和萜 类物质, 防止酚类物质氧化而发生褐变, 也可有效的去除多糖和色素，色素是PCR 反应中的强抑制剂，一定要除掉
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4. 基本步骤
（1）植物材料的采集及前处理
尽可能使组织材料保持水分而保鲜（用湿纱布包裹,放臵于密闭的冰盒等） 野外远距离采集样本时，尽可能采用冷冻保存(如放臵于液氮中) 不具备冷冻条件时 无水CaSO4 的瓶子分别保存使其迅速干燥，可将材料 保存数月，返回后尽快提取DNA 对具有大量次生代谢物(如丹宁、酚类、醌类等) 的植物材料,尽可能采集幼嫩 组织，冷冻保存、短时间内提取DNA 植物组织化学保存法 乙醇、丙二醇处理法 导致DNA剧烈降解（不推荐）
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4. 基本步骤
（7）DNA保存备用 通常用pH 8.0的TE（Tris-EDTA）缓冲液（推荐）或超纯水 于4℃或-20 ℃（推荐）冰箱保存、避免反复冻融，1-2年一般没问题
也可短时保存于100%无水乙醇中（几天）
较长期保存可放臵于-70 ℃超低温冰箱，可保存5年以上
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5. 提取缓冲液对植物总DNA提取的影响与作用
NaCl: 提供一个高盐环境, 使DNA充分溶解于液相中 异戊醇：（1）在抽提DNA时，为了混合均匀，必须振荡混匀数次，这时在 混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低 分子表面张力，减少泡沫产生。一般采用氯仿：异戊酵=24：1或酚：氯仿： 异戊醇=25: 24: 1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与 异戊醇即成） （2） 同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及 下层有机溶剂相维持稳定
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5. 提取缓冲液对植物总DNA提取的影响与作用
保护剂 还原型巯基成分: 如 β-巯基乙醇、谷胱苷肽、半胱氨酸、二硫苏糖醇等一些硫醇类物质，通 常可用于保护DNA 免受醌类物质、二硫化物、多酚氧化酶等物质的损害
抗坏血酸、维生素C :
降低醌类物质的影响 活性炭、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、重过亚硫酸钠、硼砂等: 防止多酚类物质氧化 聚乙烯吡咯烷酮(PVP) : 减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响
郑成木 主编 植物分子标记原理与方法 湖南科学技术出版社 Brown TA. 魏群等译 国外优秀生命科学教材译从 基因克隆和DNA分析 高等教育出版社
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第一部分：核酸的分离制备
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第一部分：核酸的分离制备
1. DNA在分子生物学研究中的重要性
DNA 提取是一切分子生物学研究最基础的技术，高质量的DNA是用于PCR和酶 切分析等系列后续操作的重要保证 发展了多种DNA 提取方法,可从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部 等多种组织器官中提取DNA；但不同植物、同种植物材料的不同来源、部 位、形态以及不同化学成分、组织结构特点差异,导致DNA 提取时需要选 择不同的方法或作一些特殊处理 从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取DNA的 方法难度就相对大于大多数禾谷类及蔬菜类植物 （1）多酚被氧化成棕褐色