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生物转化小组技术报告
汇报人：张妍妍 指导老师：张松 刘新利 汇报日期：2011-10-22
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由NordriDesign™提供
主要内容
一、薄层层析法（TLC） 二、硅胶柱层析分离
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一、薄层层析法（TLC）
固-液吸附色谱 优点：设备简单，分析速度快；
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d 2：比移值Rf 大，极性弱或非极性
薄层色谱示意图
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（1）薄层板的制备
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玻璃板：平整、光滑、洗净后不附水珠。 调浆：一般30g硅胶加入100gCMC-Na水溶液（0.3%～0.5％）
顺时针研磨，至无气泡。 硅胶比例大，CMC-Na水溶液有沉淀，板易裂。
涂布：薄层要尽可能均匀光滑，厚度固定（根据实验需要来确 定）, 0.251mm
请各位老师和同学提出宝贵的意见和建议。
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洗脱并收集（TLC跟踪）
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梯度洗脱：极性缓慢增大 样品收集：
如果被分离各组分有颜色，根据色层收集洗脱液。
如果各组分无色，先等分收集(自动收集器)，然后用 TLC逐一鉴定，再将相同组分的收集液合并在一起，浓度。
收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分； 1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。
电吹风吹干或干燥器内晾干。
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（3）展开剂的选择及配制
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展开剂的选择：Rf值在0.15~0.85之间。 常用溶剂及相对极性：
甲醇＞乙醇＞异丙醇＞乙氰＞氯仿＞乙酸乙酯＞二氯甲烷＞乙醚＞正己烷、石油醚
强极性溶剂 ∣←――――――中等极性溶剂―――――→∣非极性溶剂
强极性：三氯甲烷/甲醇
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硅胶柱层析分离过程中，对洗脱液进行TLC检测，如下sd：au
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最后的处理：
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送谱分析前，用少量的溶剂洗涤一下，去除杂质。 必要时进行重结晶。 如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，可除去氢谱
1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。
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Thank you for your attention!
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展开剂的配制： 新鲜配制，把各组成溶剂移入分液漏斗，使混合液充分混匀。
展开剂的饱和： 双槽的展开缸 缸内蒸气饱和时间在30min左右，防止边缘效应。 切勿使样点侵入展开剂中。放板时动作要快。 展开剂前沿上升到样点上方810cm时取出薄层板。
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（4）温湿度的控制
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定性方法 1.利用Rf定性：用标准品对照 2.板上化学反应定性：根据所用的显色剂及颜色 定量方法 1.直接定量法：比较样品和标准品斑点的面积大小颜色及颜色
深浅。目视或用薄层扫描仪。 2.间接定量法：抠下斑点，洗脱，用分光光度计比色洗脱液
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二、硅胶柱层析分离
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原理：物质在硅胶上的吸附力不同， 极性大的易被吸附，吸附解吸附。
柱子径高比一般在 1：5～10 平衡柱子（3-4个柱体积的洗脱剂）
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上样
柱内的溶剂液面降至吸附剂表层时开始上样 干法上样：样品溶解性差
样品+少量洗脱剂+少量硅胶 拌匀后烘干 优点：样品层较平整。 湿法上样：用少量展开剂将样品溶解，沿柱内壁均匀加入。 加完样后在样品层上再加入一层硅胶，防止冲散样品层。
硅胶H的处理： 活化：110 ℃烘箱干燥 l h 脱气：加入干硅胶体积一倍的溶剂
注：硅胶柱不能遇水，吸引水分子形成水膜， 影响分离效能。
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硅胶柱分离时洗脱剂选择：
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根据文献报道，尝试比例调整。 据TLC展开剂比例再稀释一倍！氯仿：甲醇=9:1（18:1）
被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂， 被分离物质为强极性成分，则须选用强极性溶剂为洗脱剂。
存放： 室温晾干！硅胶板110℃活化30min，氧化铝板在 200220℃烘4h ，放于干燥器中。
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（2）点样
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样品的溶剂：甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯。含水量越小越 好。
点样：点样斑点越小越好，直径一般以24mm为宜，可重复 点样。点样要轻，不可刺破薄层。
点样量：样品太少，斑点不清楚，难以观察；样品量太多， 往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开。
弱极性：丙酮/石油醚
混合溶剂极性高/低=1/3（V/V）
Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, MeOH/ethyl acetate, CHCl3/ethyl acetate
通常温度越低分离越好，用空调或冰柜控制； 湿度影响板的吸附能力，在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。
（5）显色（显色剂：通用、专属）
喷雾显色：雾化器，均匀细雾状 浸渍显色：专用玻璃器皿或玻璃缸 蒸气熏蒸显色：双槽玻璃缸（碘蒸气显色）
（6）检视装置
三用紫外仪253.7nm下观察ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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薄层色谱定性定量方法
极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇： 氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；
加一点点三乙胺，氨水等碱性物质来中和硅胶的酸性 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。
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装柱（最大影响因素！）
湿法装柱和干法装柱，上表面一定要平整， 一次性倾入。要求填充均匀，无断层、无缝隙、无气泡 硅胶的高度一般为15cm左右（长、粗）,据情况而定
高分辨能力，结果直观。 根据薄层层析硅胶型号分为：
硅胶 H、硅胶 G、硅胶 HF254和硅胶 GF254， 要求粒径为 5～40µm。（氧化铝） 用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01µg）的分离。
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TLC正相，极性大的物质先分离出来，极性小的后分离出来。
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1： 比移值Rf 小，极性强