45
酶切条件：酶切缓冲液 低盐组：0～50mmol/L NaCl 中盐组：50～100mmol/L NaCl 高盐组：100～150mmol/L NaCl
46
目的基因与载体的连接
磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶
47
T4-DNA连接酶： T4-噬菌体 连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）
23
3’ 3’
3’ 变性、退火
3’ 延伸
变性、退火、延伸
PCR原理图 24
2 载体DNA的选择 功能：
为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。 为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合 能力。 为目的基因提供在受体细胞中扩增和表达能力。
25
目的基因
基因载体
整合在宿主细胞染 色体DNA中
独立于宿主细胞染
29
30
ori
宿主细胞
31
抗Amp
宿主细菌
含Amp培养基
32
限制性内切酶 多种酶切口 单一酶切口
多克隆位点
33
多克隆位点
polylinker
复制起始点 ori
遗传标记
Amp
基因载体
34
35
O P
多克隆位点 转录终止区
RBS
ori
选择标记
表达型质粒载体图 36
EcoR Ⅰ
50kb
+
LA
AGCT TCGA
AGCT TCGA
AluⅠ
DNA连接酶
平端连接
51
5’
5’
AAA
TdT酶
5’ 5’ TTT
AAA
连接酶 TTT
同聚物加尾连接
52
BamHI
BamHI
BamHI
人工接头连接
53
重重组组体体的转转化化
受体细胞
54
Am
JM109感受态
重组 质粒
感受态
含氨苄平5板5
1原核细胞的转化（细菌转化）
大颗粒 内吞作用
重组体进入细胞
磷酸钙介导的转染
62
重组体
受体细胞
脂质体
脂质体法
63
重组体克隆的筛选与鉴定 转化后的克隆群体：
64
1遗传检测法 1）抗药性标志的选择
Amp Tet
pBR322
插入片段
Tet平板 Amp平板
65
2）ß-半乳糖苷酶法
66
2 电泳检测法
DNA Marker
加 样
空质粒 重组质粒
EcoR Ⅰ cI
RA
LA
lacZ
RA
m Neo
BamHⅠ
Hind Ⅲ
38
39
限制性内切酶酶切
酶切
40
41
限制性内切核酸酶
在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称 命名：酶来源的生物名称缩写
属名-种名-株名-发现次序
色体DNA外
（独立的复制子功能）
26
理想载体的基本条件：
可转移性 合适的复制位点 多克隆位点：广泛、特异 选择标志，便于筛选和鉴定 分子较小，可容纳较大的外源DNA
27
种类： 质粒 噬菌体 腺病毒载体 逆转录病毒载体 ……
28
质粒
存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。 经改造后具有多克隆位点。 举例：pBR322质粒
受体细菌
感受态 细菌
CaCl2处理
重组体转 入细菌
58
基因重组 体外包装
噬菌体
转染
噬菌体体外包装
59
3）转化率：转化细胞/细胞总数 影响因素： 载体：载体性质、空间结构、分子大小等 受体细胞 转化过程
60
2 真核细胞的转染 1）受体细胞系统
永生细胞系 细胞特异性的选择标记
对抗某种药物
61
2）转化方法 重组体 + 磷酸钙微粒
孔
重组质粒酶切
凝胶电泳检测
重组质粒的PCR 扩增片段
67
3 菌落杂交筛选法
68
4 免疫化学检测法
滤膜（固定抗体）
+
放射性抗体检测法
69
沉淀素
菌落
免疫沉淀检测法
70
5 DNA序列检测
A C T G A A G
71
真核细胞的筛选标记
P ori
Am Neo
蛋白质 合成
（-） 灭活 G418
新霉素类药物 G418筛选
pAATTCNNNNNN3' GNNNNNN5’
EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）
44
5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘
5’NNNNNGTT 3‘NNNNNCAAp
pAACNNNNN3’ TTGNNNNN5’
HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）
≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h；
48
连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接
49
CCGG GGCC
CCGG GGCC
CGG C
C GGC
CCGG GGCC
HapⅡ
CGG C
T4-DNA 连接酶
C GGC
粘端连接
50
AGCT TCGA
72
TK-
核酸补救合成
（TK酶）
氨基喋呤
（-）
核酸从头合成
TK+
氨基喋呤筛选法 73
外源基因在宿主细胞中的表达
重组子 目的基因 的mRNA 表达蛋白质
大肠杆菌（ E.coli）受体细胞
74
1目的基因在E.coli中的高效表达
三个因素： 强化蛋白质的生物合成 抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象
终止子
转录过度 影响目的基因的转录和翻译效率 干扰基因载体的复制等生物学功能 增加受体细胞的无效能量消耗
79
SD序列：影响翻译效率
SD
SD序列与16SrRNA的互补性 SD的后续序列的碱基组成 SD与起始密码之间的距离
mRNA
80
密码子： 遗传密码的偏倚性 原核生物和真核生物密码子使用的差异性
81
体外包装
转化细菌19cDNA的组建：mRNA 反转录酶
基因重组体：蛋白免疫杂交 蛋白活性鉴定
21
裂解 变性
显影
22
3）PCR技术
5’
3’
5’
引物
引物 5’
基因组
* 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键。 * 引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效 率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
有切口的载体
有切口的目的基因
DNA连接酶
重组体
转化 转染 体外包装
带重组体的宿主细胞
表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法
目的基因的表达
86
基因载体的拷贝数：
82
2 目的基因表达产物的检测 1）蛋白质的PAGE
对照 样品 Marker
83
2）表达蛋白生物学功能检测
淀粉酶基因表达
84
3目的蛋白的分离纯化
分子筛 亲和柱 离子交换 抗原抗体
目的蛋白
85
基因载体
目的基因
质粒 噬菌体 病毒151）化学合成法：
较短的核酸片段（60-80bp） 用途：PCR引物
测序引物 定点突变 酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因17外显子内含子 转录、加工修饰
结构基因

基因重组
1)受体细胞的选择
限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型： 避免重组整合 转化亲和型： 较高的可转化性 遗传互补型： 利于筛选 感染缺陷型： 防止感染
56
2）转化方法
CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG 介导转化 人工体外包装
特殊处理
受体细胞
细胞膜特性 改变
57
50-100mmol/L CaCl2
75
表达载体： 转录的启动子和终止子 核糖体结合位点 基因拷贝数 宿主细胞的翻译效率 表达蛋白在细胞中的稳定性
76
强化蛋白质的生物合成
启动子
终止子
SD
mRNA
多肽链
77
启动子： 启动子最佳作用距离-转录起始点 P
启动子的选择和改造 强启动子 可调控启动子
78
终止子： 强终止子、二聚体终止子
启动子
1
概论
2
生物技术的定义
利用 生物 (动物、植物或微生物) 或其 产物 来生产对 人类 生命科学 有用 的物质或生物。
●传统生物技术： 酿造 配育新种
●現代生物技术：以 生物化学 或 分子生物学 的
操作方法，来改变生物或其分子 (遗传) 形质，以达预期目的。
3
基因工程 生物芯片
Modern Biotechnology
价连接形成重组DNA 分子。
质粒DNA
基因片段
重组DNA
8
pSC101
EcoRI
pR6-5
大肠杆菌
Boyer 和Cohen的实验
9
pSC101
pR6-5
抗四环素
抗卡那霉素
EcoRI
DNA连接酶
抗卡那霉 素基因
重组DNA分子
10
大肠杆菌
培养平皿
四环素\卡那霉素基因 四环素平板
卡那霉素基因 11
抗四环素\抗卡那霉素 抗四环素
人类基因组计划 PCR 聚合酶链放应