脆性X综合征的产前基因筛查与诊断杨丹彤贾颐舫吴爱华张爱东【摘要】目的对脆性X综合征进行产前基因筛查与诊断。

方式采纳聚合酶链式反映(PCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对32例妊妇及其胎儿的脆性X基因(CGG)n重复序列进行检测，同时采纳PCR扩增牙幼基因对胎儿性别进行鉴定。

结果在32例妊妇及其胎儿中，检出1例妊妇为前突变携带者，1例男性胎儿为脆性X综合征患者。

结论采纳PCR扩增脆性X基因(CGG)n重复序列，结合扩增牙幼基因进行性别鉴定，可对脆性X综合征进行产前筛查与诊断。

【关键词】脆性X综合征; 聚合酶链反映; 牙幼基因; 产前诊断Prenatal screening and diagnosis for fragile X syndrome YANG Dantong, JIA Yifang, WU Aihua, et al. Shandong Provincial Key Laboratory for Improving Birth Outcome Technique Shandong Provincial Family Planning Science and Technology Institute, Jinan, Shandong 250002, China【Abstract】 Objective To screen and diagnose fragileX syndrome prenatally by PCR. Methods The CGG repeat region in the FMR 1 gene was amplified by PCR and was detected by PAGE in 32 pregnant women and their fetuses and the fetal sex was identified by the amplification of amelogenin gene. Results One premutation carrier and one male fetus with fragile X syndrome were detected from 32 pregnant women and their fetuses. Conclusion Amplification of the CGG repeat region in the FMR1 gene and the amelogenin gene by PCR can be applied for prenatal screening and diagnosis for fragile X syndrome.【Key words】 Fragile X syndrome; Amelogenin gene; Prenatal screening; Prenatal diagnosis脆性X 综合征(fragile X syndrome，FXS)是一种X连锁遗传病，是危害儿童智力发育致使儿童智力低下的要紧遗传病之一，该病的临床诊断与产前诊断一直备受关注。

1991年Verkerk等[1]发觉了FXS相关致病基因FMR1，提出FMR1基因内(CGG)n重复序列的不稳固性扩展及其上游CpG岛的异样甲基化是致使该病的分子基础。

尔后，检测FMR1基因(CGG)n重复序列及甲基化状况的分子生物学方式开始用于FXS的诊断与产前诊断。

本研究成立了稳固的聚合酶链反映(polymerase chain reaction,PCR) 扩增FMR1基因的(CGG)n 重复序列作为FXS的筛查与诊断方式，结合PCR扩增牙幼基因(amelogenin)作为性别的诊断方式，用于FXS的产前筛查与诊断，报告如下。

对象与方式一、对象2007年1月～2007年10月来本所优生遗传门诊进行羊水染色体检查的无FXS家族史妊妇30例，还有2例妊妇系FXS家系成员，其中1例已生有1个FXS男性患儿。

32例妊妇均为单胎怀胎。

妊妇于孕18～22周抽取羊水，留用5 ml，3 000 r/min离心10 min后弃上清，细胞沉淀-20 ℃保留备用。

同时取妊妇外周血5 ml，0.1mol/L EDTA 抗凝，-20 ℃保留备用。

二、方式1.基因组DNA提取：采纳基因组DNA提取试剂盒(Takara公司)，按说明提取。

1基因(CGG)n重复序列：参照文献[2]，在FMR1基因5’非翻译区(CGG)n重复序列双侧设计合成一对引物(由上海生工生物技术合成)，序列如下。

FMRF 5’GCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT3’FMRR 5’AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA3’PCR反映整体积为25 μl，含1×PCR buffer，2U Golden TaqDNA聚合酶(ABI公司)，12.5 %二甲亚砜(DMSO)，12.5 pmol/L引物，10 mmol/L dNTP，50 ng/L基因组DNA。

反映条件为：98 ℃预变性10 min，97 ℃变性60 s，61 ℃退火60 s,72 ℃延伸120 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5min。

3.PCR扩增牙幼基因：选择X Y同源牙幼基因(amelogenin)第一个内含子周围的特异序列进行扩增，引物序列如下。

Amel F 5’CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG3’Amel R 5’ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG3’反映体系为25 μl，含1×PCR buffer，1.5 U Taq酶，12.5 pmol/L引物，10 mmol/L dNTP，50 ng/L基因组DNA。

扩增条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性60 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。

4.PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测：取PCR产物10 μl加入2 μl载样缓冲液(0.05 %溴酚蓝-30 %甘油)，加样于6 %非变性聚丙烯酰胺凝胶中，300 V电泳2 h。

电泳完毕掏出凝胶前后于10 %乙醇-0.5 %乙酸溶液中固定10 min，0.2 %AgNO3溶液染色10 min，及1.5 %NaOH -0.5 %甲醛溶液显色10 min，最后以10 %乙酸溶液终止反映。

结果30例无FXS家族史妊妇外周血检测FMR1基因(CGG)n重复序列PCR扩增结果均见正常扩增带，说明为非FXS患者及FXS前突变携带者;胎儿羊水细胞FMR1基因检测亦均见正常扩增带。

羊水细胞的X Y同源牙幼基因PCR扩增结果显示，16例为男性胎儿，14例为女性胎儿。

2例FXS家系成员妊妇中，1例妊妇外周血FMR1基因的PCR结果见正常扩增带，其胎儿羊水细胞检测亦见正常扩增带且为女性，建议继续怀胎;另1例妊妇外周血FMR1基因检出正常扩增带和前突变扩增带，说明该妊妇为FXS前突变携带者，其胎儿未检出扩增带，性别检测为男性，提示该胎儿为男性FXS患者，因为该妊妇已生育一个FXS男性患者，故建议其终止怀胎。

FMR1基因PCR扩增结果，见图1。

讨论FXS是一类严峻阻碍儿童智力发育的遗传性疾病，患者表现为程度不等的智力低下、语言及运算障碍和行为问题。

自20世纪40年代初期FXS被发觉以来，人们一直致力于该病的临床诊断与产前诊断研究。

初期对FXS的诊断采纳细胞遗传学检测位于Xq27.3对叶酸灵敏的脆性位点，可是由于该方式检出率较低，容易造成误诊和漏诊[3]。

1991年Verkerk等[1]发觉了FXS的致病基因(FMR1)，为FXS的分子生物学诊断奠定了基础。

目前经常使用的有两种方式：PCR和Southern印迹。

Southern印迹因其操作繁复，费时耗力，花费高而不宜作为临床经常使用的检测诊断方式。

PCR具有简单、灵敏和快捷等优势，已普遍用于诊断FXS，而且由于其所需DNA较少，也是FXS产前诊断的首选方式[4]。

本研究中应用PCR直接扩增(CGG)n重复序列，对FXS进行了筛查与诊断。

针对扩增模板CG含量高且(CGG)n重复序列长，易形成稳固的二级结构，变性不完全而致使PCR扩增失败的问题，采纳高保真Golden TaqDNA聚合酶代替一般的Taq酶。

Golden TaqDNA聚合酶具有较高的耐高温性，因此，本研究把预变性温度提高至98 ℃并延续10 min，使CG含量高的模板充分变性。

而且Golden TaqDNA聚合酶高保真率高，可纠正DNA扩增进程中产生的错误，取得更好的扩增成效。

关于PCR产物检测，本研究采纳聚丙烯酰胺凝胶电泳，它比琼脂糖凝胶电泳灵敏度高，污染小，检测成效好。

脆性X综合征的发病率较高，男性约为1/1 250，女性为1/2 500，女性携带者高达1/350～1/700[5]。

FXS具有独特的遗传规律，属X连锁半显性遗传，男性外显率为80 %，女性为30 %，但女性携带者在传代进程中易发生(CGG)n重复序列的进一步扩展，发病风险呈逐代递增趋势[6]。

Pesso等[7]报导在不明缘故智力低下家族史背景人群中FXS前突变者携带者的比例高达1/70，而且前突变者在传代进程中发生全突变扩展的比例也较高，因此提出对育龄妇女进行FXS筛查是必要的。

中国人口基数大，FXS患者及前突变携带者总量相对较高，因此有必要对脆性X综合征进行筛查，而且筛查与诊断方式应具有准确、简便、费用低廉的特点以适合中国国情。

本研究采纳PCR直接扩增FMR1基因(CGG) n重复序列,对30例无FXS家族史妊妇和2例FXS家系成员妊妇及其胎儿进行FXS筛查，检出1例妊妇为前突变携带者，1例胎儿为患者。

由于FXS男性发病率高于女性，本研究同时采纳PCR扩增牙幼基因对胎儿的性别进行了检测，证明胎儿为男性患者。

应用PCR扩增牙幼基因检测性别灵敏度和特异性极高，从而保证了胎儿性别测定的准确性和靠得住性。

本研究成立了稳固的PCR扩增FMR1基因的(CGG) n重复序列，结合PCR扩增牙幼基因作为性别鉴定方式，用于脆性X综合征的产前筛查与诊断。

该方式操作简便、快速、费用低，具有良好的临床应用价值。

对可疑育龄妇女可通过上述方式对其中的脆性X综合征携带者及患者进行筛查，从而为患者提供遗传咨询。

(图1见封3)【参考文献】1Verkerk AJ，Pieretii M, Sutcliffe J,et al. Identification of a gene(FMR1)containing CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome[J]. Cell,1991,65(5):905914.2Fu YH, Kuhl DP, Pizzuti A, et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability, resolution of the Sherman paradox[J]. Cell, 1991, 67(6): 1047 1058.3李东至，廖灿.脆性X综合征[J].中国优生与遗传杂志,2005,13(5):121123.4曾静，王和.脆性X综合征的遗传学诊断与产前诊断[J].中国优生与遗传杂志,2006, 14(5): 4 6.5陈敬春，杨爱德.脆性X综合征的研究概况[J].国外医学妇幼保健分册,1997, 8(2): 6467.6Castellví-Bel S, Milà M, Soler A, et al. Prenatal diagnosis of fragile X syndrome: (CGG) n expansion and methylation of chorionic villus samples[J]. Prenat Diagn, 1995, 15 (9):801807.7Pesso R, Berkenstadt M ,Cuck le H, et al.Screening for fragile X syndrome in women of reproductive age[J]. Prenat Diagn,2000, 20(8):611614.。