文章编号:167121114(2008)0120008204冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化收稿日期:2007208227基金项目:天津市科学技术委员会资助项目(06ZHCXNC05900)第一作者:赵　润(1983—),男,硕士研究生.通讯作者:郭成金(1952—),男,副教授,主要从事蕈菌生物学的研究与开发.赵　润,郭成金(天津师范大学化学与生命科学学院,天津300387)摘　要:采用正交分析方法对冬虫夏草菌丝体的液体培养基配方进行了优化,结果表明,冬虫夏草生长最适液体培养基配方为:葡萄糖1.25%,蔗糖1.25%,蛋白胨0.02%,酵母粉0.0625%,KH 2PO 40.025%,MgSO 4・7H 2O0.0125%,VB 10.0025%,p H 自然;培养温度24℃,周期192h ,其菌丝体生物量产率为19.5g/L ,是前人菌丝体生物量产率的1.2～1.5倍.关键词:正交分析;冬虫夏草;菌丝体;液体培养基;优化;生物量中图分类号:Q932335 文献标识码:AOptimizing on liquid culture media of Cor dyce ps sinensis myceliaZ HA O Run ,GUO Chengjin(College of Chemist ry and Life Science ,Tianjin Normal University ,Tianjin 300387,China )Abstract :The liquid culture media of Cordyce ps sinensis mycelia was optimized by means of orthogonal analysis.The results showed that the optimal medium for the mycelia was 1.25%glucose ,1.25%sucrose ,0.02%peptone ,0.0625%yeast powder ,0.025%KH 2PO 4,0.0125%MgSO 4・7H 2O ,0.0025%VB 1and p H natural.In the cultural condition of 24℃and 192h ,the mycelia biomass reached to 19.5g/L ,which was as 1.2～1.5times as the amount with the previous way.K ey w ords :orthogonal analysis ;Cord yce ps sinensis ;mycelia ;liquid culture media ;optimize ;biomass 冬虫夏草属于真菌界(K ingdom Fungi )、子囊菌门(Ascomycota )、核菌纲(Pyrenomycetes )、麦角菌目(Clavicipitales )、麦角菌科(Clavicipitaceae )、虫草属[Cor d yceps (Fr.)Link.],英文名为Chinese Caterpillar Fungus [122].内含25%～32%粗蛋白及8.4%脂肪,富含缬氨酸、羟基缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等18种氨基酸和虫草酸(C 7H 12O 6)、四羟基环己酸以及虫草菌素(Cordycepin )等成分,虫草菌素具有一定的抗生作用和抑制细胞分裂的作用[1].现代医学认为,冬虫夏草含有可能提高人体免疫力、抗疲劳、耐缺氧、抗衰老、抗肿瘤等的虫草素、虫草酸、核苷类、甾醇类,以及人体必需的氨基酸、有益微量元素、维生素、虫草多糖、SOD 等多种营养物质和有益的活性物质.临床研究表明,虫草具有多方面功效:如能显著提高人体免疫系统能力,治疗呼吸系统疾病;抗缺氧、抗疲劳,以提高运动能力;能调节心、脑血管;具有补肾壮阳、抗肿瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、消炎的作用以及美容护肤的效果等[2].目前,通过液态深层培养可以实现菌丝体的快速生产,同时通过优化生产条件,以提高其生物活性物质的含量,便于提取目的组分[3].此外,还可通过连续性地大规模工业化生产,消除某些难以控制的环境因子,缩短生产周期,降低生产成本,为深加工提供广泛的应用领域.因此,深层发酵培养冬虫夏草具有重要的实践和理论意义.本研究在已有工作的基础上,进一步优化了冬虫夏草菌丝体液体培养基,以期为今后工业化生产以及理论研究奠定更坚实的基础.Vol.28No.1J an.2008第28卷　第1期2008年1月 天津师范大学学报(自然科学版)Journal of Tianjin Normal University (Natural Science Edition )1　材料与方法1.1　实验材料供试菌种:冬虫夏草(Cord yce ps si nensis (Berk.)Sacc.)C.S,由天津师范大学生物系蕈菌研究开发室提供.1.2　主要试剂马铃薯,棉籽壳,葡萄糖,蔗糖,蛋白胨,酵母粉, MgSO4・7H2O,KH2PO4,VB1,琼脂等均为分析纯.1.3　仪器设备YXQ G02手提式压力蒸汽消毒器,山东新华医疗器械厂;SW2C J22FD双人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司;WDP型微生物多用培养箱,广东省医疗器械厂;TDZ52WS多管架自动平衡离心机,湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司;BS224S电子分析天平,北京赛多利斯仪器有限公司;THZ2D台式恒温振荡器,江苏太仓市试验设备厂;GZX29140ME电热恒温干燥箱,天津争光真空仪器厂.1.4　培养基1.4.1　斜面培养基配方PDA加富培养基:将去皮、除芽眼的马铃薯200g煮汁后加入新鲜无霉变的棉籽壳200g,葡萄糖20.0g,KH2PO43.0g,MgSO4・7H2O1.5g,琼脂20.0g(提前浸泡2h,除杂),VB14.0mg,定容至1L,p H自然.分装于18mm×180mm的硬质试管110～130支中,塞好棉塞,管口用牛皮纸包好, 7支1捆,常规高压灭菌,>45℃时,趁热将试管取出摆放于斜面上,24h和48h后查无菌,备用.1.4.2　初选培养基配方葡萄糖3%,蔗糖3%,蛋白胨0.1%,酵母粉0.25%,KH2PO40.1%,MgSO4・7H2O0.05%,VB1 0.01%,每100mL培养瓶中装液50mL,p H自然,并放入10粒直径为3mm的玻璃珠.常规高压灭菌. 1.4.3　复选培养基配方葡萄糖0.75%,蔗糖0.75%,蛋白胨0.025%,酵母粉0.0625%,KH2PO40.025%,MgSO4・7H2O 0.0125%,VB10.0025%,每100mL培养瓶中装液50mL,p H自然,并放入10粒直径为3mm的玻璃珠.常规高压灭菌.1.5　技术路线查阅相关文献,得到已有文献的主要配方[429] (表1)→通过分析,筛选出一种相对较优配方→将培养基各成分的用量分别作1.0,1/2,1/4,1/8处理,选出较适培养基→再用正交方法进行培养基内部质量比的调整,分析数据图表→得到最适培养基配方→进一步验证试验. 表1　冬虫夏草菌丝体液体培养基的主要配方g/L成分 培养基序号12345678910葡萄糖30.020.020.020.020.030.020.020.020.0 KH2PO40.5 1.0 1.0 1.0 3.0 3.0 1.0 4.0 1.0 1.0 MgSO4・7H2O 1.00.50.50.5 1.5 1.50.50.20.5 1.0 VB10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1蛋白胨 2.0 4.010.0 1.010.0蔗糖20.020.030.0NaCl 1.00.2N H4NO3 1.0(N H4)2SO4 1.0 2.0鲜马铃薯汁80.0200.0200.0150.0玉米淀粉 5.0棉籽壳10.0酵母粉 2.5 5.0 1.0麦麸(煮汁)10.0CaCO3 3.0玉米渣 5.0黄豆粉 1.0ZnSO4 1.01.6　实验方法1.6.1　菌种的提纯复壮制备斜面培养基的同时准备4个平板培养基,用报纸包好,进行常规高压灭菌备用(步骤同上).待试管中菌丝体长满斜面后,在无菌条件下,挑取菌丝尖端部分,将大小约0.5cm2的母种块转接至平板培养基的中心位置,进行提纯复壮,选菌丝体长势健壮的备用.・9・第28卷　第1期　赵　润,等:冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化1.6.2　菌丝的液体培养按表1中的配方在无菌条件下,挑取菌丝体尖端部分,接于培养基液面上,其菌种大小约0.5cm 2,每瓶5块,每个处理重复3次.静置48h 后放入摇床中培养,培养温度24℃,摇床转速80～90r/min 恒定.待144h 后取出,以3000r/min 离心20min ,去除上清液,再用无菌蒸馏水洗涤3次,置于60℃烘箱中烘干24h 至恒重,称重.取平均值加以比较,从而筛选出一种相对较优配方.1.6.3　比较实验用筛选出的配方,将培养基中药品的用量分别作1.0,1/2,1/4,1/8处理,每个处理重复3次;同时,将4个处理分别进行摇床旋转培养(摇床转速80～90r/min )和间断静置培养(每隔12h 间断手摇1次)加以比较,以菌丝体生物量干重作为衡量指标,从而得出最适培养方式(方法同上).1.6.4　正交分析实验根据上述实验结果,筛选出较适培养基配方,按L 9(34)正交方法设计4因素3水平实验(表2),共9个处理,具体数据见表3[10]. 表2　正交实验因素和水平g/L水平因素A B C D 12.5 2.50.200　0.40027.57.50.025　0.625312.512.50.450　1.025A 为葡萄糖,B 为蔗糖,C 为蛋白胨,D 为酵母粉(下同). 表3　4因素3水平L 9(34)正交设计g/L所在列因素ABCD实验12.5 2.50.200　0.400实验2 2.57.50.250　0.625实验3 2.512.50.450　1.025实验47.5 2.50.250　1.025实验57.57.50.450　0.400实验67.512.50.200　0.625实验712.5 2.50.450　0.625实验812.57.50.200　1.025实验912.512.50.250　0.4002　结果与分析2.1　初选实验结果一般来说,对蕈菌菌丝体而言,培养基主要由碳氮源并加少量无机盐和水溶性维生素组成,而碳氮源的种类与质量比对其生物量起着决定性的作用.由表4可见,配方7培养的冬虫夏草菌丝体的生物量最高,为13.67g/L ,表明此培养基的碳氮源种类与质量较为适宜. 表4　各配方生物量比较g/L 实验号123平均值18.448.128.228.262 3.82 4.20 3.76 3.933 4.02 4.12 4.12 4.0948.088.307.968.115 6.18 5.64 6.32 6.05613.0613.1213.1213.10713.4813.7813.7413.67811.0811.3211.3811.269 5.20 5.28 5.16 5.21109.729.669.609.662.2　实验结果比较由表5可见,间断静置培养的效果显著高于摇床旋转培养,其生物量更高.另外,配方7中1/8处理所得到的生物量相对较低,说明培养基提供给菌丝体的营养不够充足.而1.0,1/2处理的浓度质量比过高,使细胞外环境水势过低,不仅阻碍菌丝细胞对养分的吸收,而且导致部分营养物质残留,造成不必要的浪费;也容易造成假生物量即55.37g/L 和59.83g/L 的结果;同时加大了培养体系中菌丝体的分离难度,使得菌丝球内部供氧不足,有碍菌丝体细胞的生长与分裂.实验证明,1/4处理的养分供给适当,菌丝片断分布均匀且颜色亮白,液体培养基清澈透明,可获得较高的菌丝体生物量(图1).表5　不同培养方式的菌丝体生物量g/L 培养方式及成分浓度　123平均值1.0×摇床55.9454.6055.5855.371/2×摇床24.3824.1624.0024.181/4×摇床12.7012.1011.9012.231/8×摇床 5.30 5.50 5.64 5.481.0×静置59.9659.2460.2859.831/2×静置30.2429.3430.5830.051/4×静置14.9415.014.7214.891/8×静置7.207.567.087.28图1　摇床(左)与静置(右)培养比较2.3　正交实验结果极差越大,反映在该因素的水平变动时,生物量的变化越大,也就是说该因素对生物量的影响越大[10].对表3进行直观分析的结果见表6.根据表6对4个不同因素的极差值(R )进行比较,按照极差・01・天津师范大学学报(自然科学版) 2008年1月大小排列出各因素对生物量影响的主次顺序是B> A>D>C,即蔗糖是影响菌丝体生物量的主要因素,葡萄糖次之.表中K1,K2,K3之间的差异是4个因素取3个不同水平所引起的,K值较大的因素水平是较好的培养条件[11].根据水平之间K值大小可得到最佳培养基配方组合为A3B3C1D2,即葡萄糖1.25%,蔗糖1.25%,蛋白胨0.02%,酵母粉0.0625%.由表6中各因素水平的均值绘制冬虫夏草碳氮源筛选的效应曲线图(图2),结果表明,在上述各因素质量配比条件下,其菌丝生物量最大,为19.5g/L. 表6　碳、氮源筛选的直观分析g/L 所在列因素A B C D实验结果实验111114.040实验212228.927实验3133313.667实验421239.573实验5223113.153实验6231219.500实验7313212.753实验8321317.567实验9332114.940K18.888.7913.7010.71K214.0813.2211.1513.73K315.0916.0413.1913.60R6.217.252.553.02　K为均值,R为极差.　图2　碳氮源筛选的效果曲线图3　结论生物在其生长发育过程中,始终贯穿着呼吸作用.蕈菌是一类大型高等好氧真菌,在它一生中,均伴随着氧的参与[2].试验中,在培养瓶内放置若干玻璃珠,可促使气体交换,菌丝细胞可获得更多的氧气,促进其生长发育;而且在摇晃过程中,通过菌丝与玻璃珠之间的碰撞可产生大量菌丝片段,使蕈菌菌丝前端分裂的特点得以充分发挥.细胞吸水的主要方式是渗透吸水,细胞的渗透吸水取决于水势,细胞与细胞、细胞内与细胞外溶液之间的水分移动方向与速度决定于两者的水势差,水分从水势高处流向水势低处,差值越大,移动越快,反之则越慢.在菌丝体生长阶段,所需要的水分主要来源于培养基,培养基成分的浓度质量比过高,会使细胞内部失水,造成生理干旱,导致菌丝生长速度缓慢.因此,在研究过程中,将培养基中各营养成分的含量降低,最终获得平衡营养,以达优化液体培养基之目的.此方法也大大降低了实验成本,为今后进一步扩大再生产提供了基础依据;同时,也为开展原生质体的制备、DNA的提纯以及分子水平上的深入研究提供了便利.本研究采用正交方法L9(34)设计4因素3水平实验,以培养冬虫夏草菌丝体的生物量为衡量指标,得到了冬虫夏草菌丝体最适液体培养基配方为:葡萄糖1.25%,蔗糖1.25%,蛋白胨0.02%,酵母粉0.0625%, KH2PO40.025%,MgSO4・7H2O0.0125%,VB1 0.0025%;最适液体发酵条件为:培养温度24℃, p H自然,采用静置培养,间断性手摇(每隔12h 1次),培养时间192h,其菌丝体生物量平均为19.5g/L,是已有研究结果的1.2～1.5倍[9].参考文献:[1]　董洪新,吕作舟.冬虫夏草的研究概况[J].中国食用菌,2002(2):527.[2]　郭成金.蕈菌生物学[M].天津:天津科学技术出版社,2005:54255,2272230,2982299.[3]　Wang Zhaolong,Wang Xiaoxia,Chen Weiying.Inhibitory effectof Cordyceps sinensis and Cord yceps militaris on human glo2 merularmesangial cell proliferation induced by native LDL[J].Cell Biochemical Fungus,2000,18(2):93297.[4]　张建辉.冬虫夏草蛹虫草姬松茸的液体培养条件及其富锌硒的研究[D].沈阳:东北农业大学,2003.[5]　张伟.冬虫夏草液体培养基的筛选和液体发酵技术研究[J].中国医学生物技术应用杂志,2004(1):42246.[6]　王化河,李明奇.人工冬虫夏草发酵培养基的优化研究[J].数理医药学杂志,2005,18(3):2512252.[7]　尹萍,涂艳丽,尹辉,等.北虫草液体发酵培养基优化研究[J].江西农业学报,2006,18(4):102210.[8]　赵桂云,李风云,雷景敏,等.冬虫夏草菌丝液体培养碳氮源最佳组合的研究[J].中国林副特产,2002(4):20221.[9]　武忠伟,郭爱莲,张海滨.数理统计法优化冬虫夏草发酵培养基的研究[J].食品科学,2004,12(25):1082111.[10]　李春喜,姜丽娜,邵云,等.生物统计学[M].3版.北京:北京科学出版社,2005:1772184.[11]　高玉荣,卢艳明.灵芝菌丝液体深层发酵培养基的研究[J].中国酿造,2006(1):18220.(责任编校南凤仙)・11・第28卷　第1期　赵　润,等:冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化。