• 1.标准曲线的测定:
• 例如：用培养液将待检细胞重悬，得到 细胞悬液，按照4x10^4/ml细胞密度梯度 ,分 别接种于 96孔板 ,每孔 100μl,重复 3孔;采用 MTT法测量吸光值A值,同一浓度下测得的A值 为该浓度下3孔的平均值。 依检测结果 ,得到吸光值 A值与细胞浓度 的对应关系，绘出标准曲线。
• 通常地，细胞生长曲线的函数拟合模型是
Y a e
Y a 2
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b t
• 但由于细胞增值是二次分裂生长，所以选用
b t
• 作为细胞生长曲线的拟合模型更为合适。
• 又因为在SPSS中的曲线拟合功能选项中并没有 的 Y a 2b t 函数拟合模型，只有 Y a eb t • 于是我们可以通过变换
•
• 2.细胞生长曲线的测定:
• 例如：用培养液将待检细胞制成 1×10^4/ml的细胞悬液;分别接种于多块96孔 板 ,每孔 100μl ;在 24、 48、 72、 96及 120 h时间点取一块 96孔板 ,采用 MTT法测 量吸光值A值得到吸光值A值与时间的关系。 根据标准曲线计算出相应的细胞数 ,再绘 出细胞的生长曲线。
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• • •
2.细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简 化计算
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• 曲线拟合
• 曲线拟合（curve fitting）是指选择适当的曲线类 型来拟合观测数据，并用拟合的曲线方程分析两 变量间的关系。
• SPSS
• SPSS是世界上最早的统计分析软件，由美国斯坦 福大学的三位研究生Norman H. Nie、C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent于1968年研开发成功， 同时成立了SPSS公司，并于1975年成立法人组织、 在芝加哥组建了SPSS总部。 • 1984年SPSS总部首先推出了世界上第一个统计分 析软件微机版本SPSS/PC+，开创了SPSS微机系列 产品的开发方向，极大地扩充了它的应用范围， 并使其能很快地应用于自然科学、技术科学、社 2019/2/27
•
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2.MTT法（复杂，误差小）
• 原理 • MTT：全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide • 汉语化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四 氮唑溴盐 • 商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。
以存活细胞数(万/mL)对培养时间 (h或d)作图，即得生长曲线。 一般而言，我们主要研究的是对 2019/2/27 数生长期的生长曲线。
测定细胞生长曲线的方法
1.细胞计数法（简单、最常用、有误差）
• • （1）传代后把细胞重悬，得到细胞悬液，把悬液均匀加到24孔板中 （2）24 h后开始进行细胞计数，以后每隔24 h计数一次，每次取4孔细胞， 分别进行计数，计数结果取4孔的平均值。连续计数6天。 • （3）根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为 横坐标绘制生长曲线。 • 24孔板 细胞计数板
t 24h( Lg 2 / [ Lg (a eb t ln 2 ) Lg (a eb t0 ln 2 )] t 24h( Lg 2 / [ Lg (a 2 ) Lg (a 2
bt b t0
)])
t (24h( Lg 2 / b((t t0 ) Lg 2)
t[24h( Lg 2 / (b t Lg 2)]
Y a 2 ln 2b t b t ln 2 a e a e b k (其中k t ln 2) a e
b t
• 从而能使用SPSS中的函数拟合模型进行曲线拟合。
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• 原始数据
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• 曲线1. 培养天数 X ln2
k t ln 2
Ya e
b k
• 曲线2. • 进入对数生长期天数 X ln2
24h / b
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• 结果 • 曲线一. • b=0.855
Td 24h / b 28.070h
• 曲线二. • b=0.921
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Td 24h / b 26.059h
Td =t Lg2 / ( LgNt LgN0 )
• （Nt为对数生长期任一点的理论观察值,N0 为对数生长期理论初始值） • 计算比较复杂,而我们基于以往曲线进行理 论推导而行的理论倍增时间,计算相对简单。
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• 推导过程
Td t 24h[ Lg 2 / ( LgNt LgN0 )]
m=（t-2） ln2
Ya e
b m
• 依据以上变量进行曲线拟合 ,记录相应的a,b值。 2019/2/27
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2.2 细胞群体倍增时间的简化计算方法
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• 细胞群体倍增时间的计算方法有2种。 • 1.做图法:在细胞生长曲线的对数生长期找 出细胞增加一倍所需的时间,即倍增时间, • 2.公式法,按细胞倍增时间计算细胞群体倍 培时间,其为公式为：
•
活细胞的线粒体中琥珀酸脱氢酶能够使外源性 的MTT还原，同时在细胞色素C 的作用下，生成不 溶于水的蓝色（或蓝紫色）络合物甲臜。 • 按照时间间隔，通过酶联免疫检测仪在490nm （或570nm）波长处测定甲臜 的光吸收值（A值）。 • 在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比， 因此可根据光吸收值推算出活细胞的数目。 • 由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入 MTT 不会有反应。 • 2019/2/27
1.MTT比色法测定细胞生长曲线 2.细胞生长曲线的拟合及细胞群体倍 增时间
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细胞生长曲线
• 细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也 是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性 的基本参数之一。
一般细胞传代之后，经过短暂的 悬浮然后贴壁，随后度过长短不同 的迟缓期（潜伏期），即进入大量 分裂的对数生长期。在细胞达到饱 和密度后，停止生长，进入稳定期， 然后退化衰亡。