第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
位阻效应使分子共面性下降，荧光减弱。
d.顺反异构体
H C=C H
HH C=C
b.拉曼光(Raman scattering light):光子和物 质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向 发生改变，也发生能量交换，光子把部 分能量转移给物质分子或从物质分子获 得部分能量，发射出比入射光稍长或稍 短的光，称拉曼光。
拉曼光对荧光测定干扰较大。 消除拉曼光的方法： 选择适当的激发波长。
8
3.激发单色器
5.样品池
9
6.表面吸光物质 8.发射单色光
10.检测器
11.放大器
11
10
12.指示器
13.记录器
图 荧光分光光度计结构示意图
光源：氙灯，高压汞灯 单色器：滤光片，光栅 检测器：光电倍增管
荧光分析新技术
• 时间分辨荧光分析 在激发和检测之间延缓一段时间，使
具有不同荧光寿命的物质达到分别 检测的目的。 光源：脉冲激光 应用：免疫分析
由朗伯-比耳定律：
• I=I0×10-εcl • Ia = I0(1-10 - l c ) • F = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c )
当 l c <0.05时，
F=2.3K′I0ECl=KC ——荧光定量的依 据。
二、定量分析方法
1.校正曲线法
以荧光强度为纵坐标，对照品溶液的 浓度为横坐标绘制校正曲线，在同 样条件下测定试样溶液的荧光强度， 由校正曲线求出试样中荧光物质的 含量。
3.荧光分析法(fluorometry)：根据物质 的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定 和含量测定的方法。
荧光分析法的优点： 灵敏度高;选择性好; 检测限达10-10g/mL,最低可达10-12g/mL。
11.2 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 (一)分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程 1)分子的电子能级 △E= △Ee +△Ev+ △Er
5.散射光(scattering light)：
定义：当一束平行单色光照射在液体 样品时，大部分光线透光溶液，小 部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向发生改变而向不 同角度散射，称散射光。
包括瑞利光和拉曼光。
a.瑞利光(Reyleigh scattering light):光子和 物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交 换，仅仅是光子运动方向发生改变，波 长与入射光波长相同。
2
b.内部能量转换(internal conversion):
简称内转换，当两个电子激发态之
间的能量相差较小以致其振动能级
有重叠时，受激分子常由高电子能
级以无辐射方式转移至低电子能级
的过程。如S2*
S1*
c.外部能量转换(external conversion)
简称外转换，溶液中的激发态分子 与溶剂分子或与其他溶质分子之间相 互碰撞而失去能量，并以热能的形式 释放能量的过程。
瑞利光 拉曼光
瑞利光 拉曼光
结论：无论选择320nm或350nm为 激发光，荧光峰总是在448nm. 而空白溶剂分别在320nm及 350nm激发光照射下测定，测得
的实际上是散射光而非荧光。
表 在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长
λex
水 乙醇 环己烷 四氯化碳
248 313 365 405 436
F-F0 100
80
60
· ------------------------------
40
·
·
20
· ·
Cx 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 C(µg/ml)
荧光法测定硫酸奎宁标准曲线
2.比例法
当校正曲线通过原点，可取已知量的 对照品配制一对照品溶液(Cs),使其 浓度在线性范围内，测定荧光强度 (Fs),在同样条件下测定试样溶液的 荧光强度(FX),按比例关系计算荧 光物质的含量。
如：S1*:V4,V3,V2,V1 V0
S2* 3
V4 V3 V2
V1 c
V0
S1*
b
V4
V3
V2
V1
V0f
E
aa
d
e
4
V4 V3
T * V2
V1 1
V0
g
S0
5
λ1
λ2
λ3
λ4
图 荧光和磷光产生示意图
1
a. 吸收 b. 振动驰豫 c. 内转换 d. 荧光 e. 外转换 f. 体系间跨越 g. 磷光
FS F0 CS FX F0 CX
CX
FX FS
F0 F0
CS
11.4 荧光分光光度计
1.荧光分光光度计的主要部件 由激发光源、激发单色器(置于样
品池前)、发射单色器(置于样品 池后)、样品池、检测系统组成。
岛津RF-5301PC型荧光分光光度计
5
1 12 13
2
3
4
76
1.光源
2.4.7.9.狭缝
• 同步荧光分析
在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中 选择一适宜的波长差值△λ，同时扫 描荧光发射波长和激发波长，得到 同步荧光光谱。
Fsp(λem,ex) = KcFexFem
• 胶束增敏荧光分析
胶束溶液：一定浓度的表面活性剂溶液。
胶束溶液特点：具有一个极性的亲水基 和一个非极性的疏水基，在极性溶剂 中，几十个表面活性剂分子聚合成团， 将非极性的疏水基尾部靠在一起，形 成亲水基向外、疏水基向内的胶束。
外转换常发生在第一激发单重态或激 发三重态的最低振动能级向基态转换 的过程中。
d.体系间跨越(intersystem crossing):
处于激发态的电子发生自旋反转而使
分子的多重性发生变化的过程。
如：S1*
T1*
2.辐射跃迁
a.荧光发射：处于任一激发单重态的 分子，通过内转换及振动驰豫，可回 到第一激发单重态的最低振动能级， 然后再以辐射形式发射光量子而返回 至基态的任一振动能级，这时发射的 光量子称为荧光。
对π电子共轭体系作用小，对荧光 作用不明显。
三、影响荧光强度的外部因素
1.温度 T ,f ,F
2.溶剂 溶剂极性增强， λem 长移，F 溶剂粘度 ，F
3.酸度
如：苯胺
NH3+ OH-
NH2 OH-
NH-
H+
H+
pH<2 无荧光
pH=7~12 蓝色荧光
pH>13 无荧光
4.荧光熄灭剂
1）荧光熄灭(荧光焠灭)：荧光物质 分子与溶剂分子或其他溶质分子相 互作用引起荧光强度降低的现象。
271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 — 320 375 418 450
选择激发光波长时，应使溶剂不干扰 测定。
11.3 定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系 • 荧光强度F正比于吸收的光量子Ia和荧
光量子效率 ： F = Ia Ia= I0 - I F∝(I0 - I)
λ 荧光 > λ激发光 2）荧光光谱的形状与激发光波长无关。 3）荧光光谱与激发光谱成镜像关系。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、分子结构与荧光的关系
(一)荧光寿命和荧光效率
1.荧光寿命(fluoresce lift time)当除去 激发光源后，分子的荧光强度降低 到最大荧光强度的1/e所需的时间， 常用τf表示。 荧光物质从激发态到基态的变化用 指数衰减定律表示：
• 利用荧光分子寿命的差别，可以 进行荧光物质混合物的分析。
2.荧光效率(fluorescence efficiency) 又称荧光量子产率(fluorescence
quantum yield),指激发态分子发射荧 光的光子数与基态分子吸收激发光 的光子数之比，常用i 表示。