（Brassinosteroid，BR）对辣椒胎座 Kas 基因的表达有促进作用，在处理 24 h 后 Kas 表达量达到最高，随后逐渐降
低。该基因的克隆与表达分析为深入研究辣椒 Kas 基因表达调控和辣椒素的生物合成机制奠定了重要基础。
关键词：辣椒素；3-氧酰基[酰基载体蛋白]还原酶（Kas）；油菜素内酯；表达分析
Plant Sciences, Jilin University, Changchun 130062, China)
Abstract: A full length of 3 456 bp Kas (3-oxoacyl- [acyl-carrier-protein] synthase) gene (GenBank accession: HQ229922) was obtained from genomic DNA of Capsicum annuum Yidu-Red by PCR method.
辣椒素类物质是辣椒次级代谢的产物，其生物 合成途径主要由香草基胺和 C9~C10 支链脂肪酸两 部分组成[8-9]。近年来，国内外研究者对辣椒代谢 途径进行了大量深入的研究，也取得了不少研究成 果。Stewart 等对辣椒素的生物合成途径进行了补 充，并对辣椒素生物合成相关基因 Pun1 进行了深 入研究[10-11]。Mazourek 等系统总结了辣椒素生物合 成代谢网络，提出了辣椒素生物合成模型 （CapCyc model）[13]。但是对辣椒素代谢网络中的基 因功能研究仍然有限，仅有部分基因被详细研究， 例如：AT3 的缺失与辣椒辣味有无有关[11]。
在辣椒素生物合成途径中，3-氧酰基（酰基载 体蛋白）还原酶位于脂肪酸合成支链上。Kas 与酰 基转运蛋白酶（Acyl carrier protein，Acl）和 ACP-酰 基硫酯酶（Acyl-ACP thioesterase，FatA）组成了脂 肪酸合酶（Fatty acid synthase，FAS）复合体，催化 脂肪链的延伸[12]。脂肪烃链的延伸方式与枯草芽孢 杆菌（Bacillus subtilis）膜脂的生物合成很相似 [13]。 Abraham -Juarez 等 利 用 病 毒 介 导 的 基 因 沉 默 （Virus-induced gene silencing，VIGS） 技术研究了 Comt、pAmt 和 Kas 基因表达水平与辣椒素的积累 量关系[14]。任何一个基因 Comt、pAmt 和 Kas 的沉 默都会导致辣椒素含量的急剧下降。Nemhauser 等 发现植物激素油菜素内酯（Brassinosteroid，BR） 处 理诱导表达的 342 个基因中有四分之一同时受到 生长素的诱导，这些被共同调控的下游基因参与 细胞生长、新陈代谢、细胞壁合成和信号转导等 各个过程[15]。辣椒素作为辣椒的次级代谢产物，其 代谢通路基因的表达水平与辣椒素的积累量密切 相关。Maneesha 等克隆了辣椒（Capsicum chinese） 的 Kas mRNA 序列，但辣椒（Capsicum annuum L.） Kas 的 DNA 序列仍未见报道 。 [16] 另外，植物激素 油菜素内酯对 Kas 表达的调控也未见报道。为了
摘 要：3-氧酰基[酰基载体蛋白]还原酶（3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase，Kas）在辣椒素生物合成

途径中起着重要作用，但其全长 DNA 序列仍未见报道。以辣椒益都红基因组为模板，根据同源性设计特异引物
PCR 扩增得到辣椒 Kas 基因 DNA 序列（GenBank 登录号：HQ229922）。Kas DNA 序列全长 3 456 bp，有 8 个外
显子区域，编码 488 个氨基酸；推测蛋白分子质量为 52.2 ku，等电点 8.24。经同源比对分析得出，辣椒 Kas 与
其他物种 Kas 有一定同源性；其中，与小米椒的遗传距离为 0.0723。通过半定量 RT-PCR 分析发现，Kas 在胎座
中的表达量要高于肉质体中的表达量，授粉 10 d 后 Kas 的表达量逐渐降低 。另外，植物激素油菜素内酯
深入研究 Kas 的表达调控与外源植物激素激素 BR 对辣椒素生物合成量的影响，本文以辣椒益都红 为材料，采用 PCR 技术对 Kas 基因进行克隆分析， 利用半定量与实时定量 PCR 技术对 Kas 基因进行 了表达分析，采用生物信息学的手段分析了辣椒 Kas 与其他物种的进化关系，为进一步研究辣椒素 代谢网络的基因功能及其表达调控机制提供理论 基础。
This gene consists of eight extrons, encodes 488 amino acids. The molecular weight and pI of the putative protein were 52.2 ku and 8.24, respectively. The putative amino acid sequences shared high identity to Kas gene of other plants. Especially Capsicum chinese, they share about 98% homology. In this study, the expression pattern of Kas gene at different time point after pollination in flesh and placenta was examined by semi-quantity RT-PCR. The mRNA abundance of Kas in placenta was higher than that of flesh. In addition, the Kas expression level decreased 10 d after pollination. Furthermore, the effect of brassinosteroid on this gene expression was investigated. The results showed that the mRNA abundance of Kas gene dramatically increased 6 h after treatment with brassinosteroid and reached a peak after 24 h and then decreased slowly. This results illustrated that brassinosteroid had a positive effect on Kas expression. Accordingly, this study will provide the basis for further studying the expression and regulation mechanism of Kas and its role in the biosynthesis mechanism of capsaicin.
第1期
阮文渊等：辣椒中辣椒素生物合成途径基因 Kas 克隆及表达研究
中图分类号：S641.3；Q785
文献标志码：A
文章编号：1005-9369（2011）01－0103－06
Cloning and expression of Kas gene related to capsaicin biosynthesis in Capsicum annuum L./RUAN Wenyuan, JIA Chengguo, LI Yanlei, GUO Qingxun (College of
用 改 良 的 CTAB 法 提 取 辣 椒 叶 片 基 因 组 总 DNA。用 RNAiso Reagent 提取辣椒果实肉质体与 胎座总 RNA，经核酸测定仪和琼脂糖电泳确认质 量和产量后，-20 ℃保存备用。反转录 cDNA 的制 备参照 BioFlux 公司反转录试剂盒说明书。 1.3.2 Kas 基因的克隆
1 材料与方法
1.1 材料 以辣椒益都红（Capsicum annuum L.）为试材，
播种于吉林大学农业实习基地，并进行人工授粉。 克隆菌株为大肠杆菌（Escherichia coli.）Top10，由 本实验室保存。 1.2 试剂
Pfu DNA 聚合酶（2.5 U·μL-1）购自 MBI 公司； 高 纯 dNTP（2.5 mmol·L -1 each）， 荧 光 染 料 Real Master Mix（SYBR Green）和克隆载体 pGM-T Easy vector 均购自天根生化科技（北京）有限公司；RNA 提取试剂 RNAiso Reagent 与核酸限制性内切酶购 自 TaKaRa 公司；反转录试剂盒，Biospin 胶回收试 剂盒，质粒提取试剂盒购自 BioFlux 公司；引物合 成由南京金思特科技有限公司完成；其余试剂为国 产分析纯；荧光定量 PCR 管购自 Axygen；24-表油 菜素内酯（24-epibrassinolide，EBR）购自北京鼎国。 1.3 方法 1.3.1 DNA\RNA 的提取和 cDNA 模板的制备
第 42 卷 第 1 期 2011 年 1 月
东北农业大学学报 Journal of Northeast Agricultural University
42(1): 103~108 Jan. 2011
辣椒中辣椒素生物合成途径基因 Kas 克隆及表达研究
阮文渊，贾承国，李彦磊，郭庆勋*
（吉林大学植物科学学院，长春 130062）
Key words: capsaicin; 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase (Kas); brassinosteroid (BR); expres-
sion assay
辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科辣椒属草本 来[1]，并命名为 8-甲基-6-癸烯香草基胺，分子式 植物。辣椒素由 Thres 于 1876 年从辣椒中分离出 为 C18H27NO3，是一种含香草酰胺的生物碱。辣椒