高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术在比格犬中的建立及应用董立厚，宋海峰*（军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100851）【摘要】目的：在比格犬中建立高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术。
方法：以5只健康比格犬为实验对象进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验，考察血糖、胰岛素、C 肽及胰高血糖素等指标。
结果：成功将血糖控制在目标水平，变异系数小于5%；实验过程中血清胰岛素最后稳定在40.0 ±3.8 mIU·L-1，显著高于基础胰岛素水平；血清C肽浓度显示内源性胰岛素受到了明显的抑制，胰高血糖素没有显著升高。
结论：在比格犬体内建立高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术，并将其成功用于胰岛素制剂药效动力学的评价。
【关键词】：高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术；药效动力学；比格犬The euglycemic clamp technique was established in beagle dogs [Abstract] Objective:To establish euglycemic clamp technique in beagle dogs. METHODS:The euglycemic clamp technique was applied in healthy beagle dogs and the blood glucose, insulin, C-peptide, insulin and glucagon were monitored during the clamp period. RESULTS: The blood glucose level was controlled within the basal level, coefficient of variation being less than 5% during the clamp period. The serum insulin concentration finally reached to the level of 40.0 ±3.8 mIU·L-1 stably and a significant inhibition was showed in endogenous insulin by the determination of C-peptide. But there was not significant increase of serum glucagon compared with basal values. CONCLUSIONS:Methodology confirmed that the euglycemic clamp technique is successful in beagle dogs and can be applied in study of pharmacodynamics of insulin preparations.KEY WORDS: euglycemic clamp technique; pharmacodynamics; beagle dogs高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术[1]由于定量准确、可重复性好、避免低血糖等优点，已成为胰岛素敏感性评价的金标准[2]。
近年来该技术已扩展应用于胰岛素制剂药代动力学及药效动力学评价方面[3-6]，但目前国内在此方面应用的报道较少，特别是在比格犬中的应用还未见报道。
国外文献对于该方法也只有概略性的描述，没有提供方法质控的指标。
本实验旨在归纳总结现有文献报道，将该技术细节及技术指标进一步明确，以利于该技术在比格犬中的应用。
1材料与方法1.1动物健康比格犬5只，体重12 ± 2 kg，军事医学科学院动物中心产。
动物生产许可证号：京动SCXK字0046591号。
分笼，用比格犬标准饲料饲养，定时通风、【作者简介】董立厚（1979 —），男，河北清河县，博士研究生，研究方向：生物技术药物药代动力学*通讯联系人，宋海峰，songhf@，Tel: (010)66930259光照，自由饮水。
在实验前一周将其悬吊在巴甫洛夫吊带内进行适应性训练。
1.2药品及试剂受试药品：皮下注射用常规胰岛素：江苏万邦生化股份有限公司生产，批号0412A10，在无菌条件下溶解于含0.2％的白蛋白注射用水中。
猪胰岛素测定采用美国R&D SYSTEMS公司产Quarantine® IVD® human Erythropoietin ELISA试剂盒测定；C肽放免试剂盒及胰高血糖素放免试剂盒（由解放军总医院免疫实验室提供并检测）。
1.3仪器艾美达μVP5005输液泵（瑞士艾美达生产）；艾美达μSP5005注射泵（瑞士艾美达）；强生血糖仪（稳豪型，美国强生公司）；Microscan MK2全自动酶标仪（芬兰Labsystem公司）。
1.4方法1.4.1高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术的建立比格犬禁食14-16 h后，用巴甫洛夫吊带固定在实验架上。
在比格犬一侧前肢建立静脉输注通道，该通道连接三通管，一端连接胰岛素注射泵，一端连接葡萄糖输注泵；在另一前肢穿刺并留置导管作为取血通道测量血糖，用电热毯包裹加热，将其温度控制在45-55℃左右以使静脉血动脉化[7]。
待比格犬安静30分钟后，连续测定3次基础血糖，每次间隔10分钟，待血糖稳定后，将目标血糖设为基础血糖水平。
首先快速输注胰岛素（8 mU·kg-1·min-1）迅速将胰岛素提高到较高的浓度水平，以抑制内源性胰岛素的分泌，然后逐渐降低速度，大约10min 后血糖下降，将胰岛素输注速度设定为0.8 mU·kg-1·min-1[8,9]。
间隔5min测血糖，根据血糖调节葡萄糖输注速度，调节血糖在目标范围内，避免低血糖引起神经内分泌反应。
并分别于0、10、30min，1、1.5、1.75、2 h取血并检测胰岛素及C 肽的血清浓度。
钳夹结束时，首先停止泵入胰岛素，预防低血糖发生。
然后逐渐减少葡萄糖输入速度。
实验血液样品均经离心分离血清后置于-20 ℃保存待测。
1.4.2血清胰岛素、C肽及胰高血糖素的检测应用放射免疫分析（RIA）方法检测血清样品中胰岛素、C肽及胰高血糖素的浓度。
1.4.3结果计算及统计方法计算各比格犬24次血糖值的均数（X ）和标准差（S ）,再按S/X 计算血糖变异系数。
本实验采用自身配对试验设计，基础状态与钳夹稳态期比较采用配对t 检验。
2结果2.1血糖水平5只比格犬的基础血糖水平为4.0 ± 0.1 mM·L -1。
钳夹建立后，5只比格犬由于个体差异导致葡萄糖输注率（GIR ）差异较大，但血糖均迅速达到目标水平。
钳夹达到平衡后，5只比格犬的血糖水平为3.9 ± 0.1 mM·L -1，与基础状态无统计学差异（p>0.05）。
实验过程中，由于外源性胰岛素输入导致动物血糖下降及葡萄糖输注速度调节的延滞性，造成钳夹建立过程中有个别时间点血糖浓度稍低于目标水平。
但整体血糖水平都控制在目标范围内，血糖变异小于5%。
246810t (h)血 糖 水平( m M .L -1 )G I R (m g .-1.m i n -1)图1 比格犬在钳夹建立过程中血糖及GIR-时间曲线2.2葡萄糖输注率外源性胰岛素在钳夹实验开始后前10分钟的迅速输注，体内外源性胰岛素水平迅速升高，在15分钟后开始发挥降糖作用，葡萄糖输注率在钳夹实验开始15分钟后也相应迅速增加。
35 min 达峰后呈缓慢降低趋势,于90~120 min 趋于稳定，最后固定在7.3 ± 0.7 mg· kg -1·min -1。
2.3比格犬血清胰岛素5只比格犬基础胰岛素浓度为5.8 ± 0.4 mIU·L -1。
从5只比格犬血清胰岛素抗原C-T 曲线中可见，由于前10 min 胰岛素输注速度很快，至10 min 后血清胰岛素抗原浓度迅速升高至170.5 ± 15.3 mIU·L -1左右，然后随着输注速度降低而下降，1.5~2 h 后钳夹形成，胰岛素浓度基本处于稳态，约为40.0 ± 3.8 mU·L -1。
2.4比格犬血清C 肽血清中C 肽可以反映内源性胰岛素分泌情况。
比格犬的基础C 肽浓度为0.24 ± 0.04 μg·L -1；钳夹实验开始后，C 肽浓度逐渐降低。
1.5~2 h 钳夹建立后，各时间点的C 肽浓度为0.09 ± 0.03 μg·L -1，较比格犬的基础C 肽水平显著降低(P<0.01),抑制程度在60%左右。
t (h)胰岛 素浓 度（m I U .L-1）C 肽（μg .L -1）图2 比格犬在钳夹建立过程中平均胰岛素及C 肽的浓度-时间曲线2.5比格犬血清胰高血糖素钳夹稳态期与基础状态相比较,胰高糖素的水平无显著性差异（70 vs 64 pg ·mL -1）。
3应用实例本实验室利用该技术对比格犬给予不同胰岛素制剂后的药效动力学性质进行了评价（见图3与表1）。
实验结果明确阐明了两种不同胰岛素制剂在比格犬中的药效动力学性质差异，使人们对两种胰岛素制剂的特征有了深入的认识，从而为药物的临床应用奠定基础。
G I R (m g /k g /m i n )Time/min图3 高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术在比格犬给予不同胰岛素制剂后平均GIR-T 曲线表1 比格犬给予不同胰岛素制剂后各组药效动力学参数的比较（n = 10）参数口服胰岛素（16 U ） 注射胰岛素（5 U ） T Effect (min)48 ± 38 23 ± 11 T max (min)265 ± 56 151 ± 35 GIR max (mg/kg/min)6.9 ± 2.2 14.0 ± 3.2 GIR-AUC (0-600) ( mg/kg) 2735 ± 1152 4747 ± 8974讨论高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术的优点在于通过向受试对象输注外源性葡萄糖及胰岛素，打破了体内葡萄糖-胰岛素的负反馈调控，将血糖浓度控制在正常水平，从而将血糖波动造成的神经、激素等内源性干扰降到最小，增加了实验的可重复性与准确性。
高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术关键在于维持血糖平衡，对外源性葡萄糖输注速率的调节要求很高。
从实验数据分析认为外源性葡萄糖从进入血液到分布平衡需要5~10分钟，而实验中我们是每隔5分钟进行一次血糖调节，所以在调节血糖时，5分钟前血糖调节的结果还没有完全显现出来。