・胰岛素抵抗・基金项目:上海市科技发展基金资助项目(974119026);上海市“医学领先专业重点学科”基金资助项目(993024)作者单位:200233上海市第六人民医院内分泌代谢科,上海市糖尿病研究所扩展高胰岛素2正葡萄糖钳夹技术的建立贾伟平 陈蕾 项坤三 陆俊茜 包玉倩 薛凤仙 陆蔚 【摘要】 目的 建立扩展高胰岛素2正葡萄糖钳夹技术。
方法 应用扩展葡萄糖钳夹技术(即联合葡萄糖钳夹、323H 标记葡萄糖示踪技术及间接测热技术)对9例正常体重、正常糖耐量者进行方法学研究。
结果 (1)在优势浓度胰岛素、血浆葡萄糖稳定在正常水平状态下肝糖产生完全被抑制,未见到升糖激素(皮质醇、生长激素、胰高血糖素)显著兴奋及内源性胰岛素释放。
(2)扩展高胰岛素2正葡萄糖钳夹稳态期,胰岛素介导的机体葡萄糖利用率(葡萄糖消失率)较基础状态显著增加〔(5.86±0.65)mg ・kg -1・min -1比(2.45±0.15)mg ・kg -1・min -1,P <0.01〕,并以糖原合成为主;脂肪氧化被显著抑制,游离脂肪酸浓度显著下降。
结论 扩展高胰岛素2正葡萄糖钳夹技术已成功建立;在外源性胰岛素2葡萄糖代谢的稳定状态下,机体对葡萄糖利用显著增加,脂肪分解显著减少。
【关键词】 葡萄糖钳制技术;扩展高胰岛素2正葡萄糖钳夹技术;代谢Establishment of an extended hyperinsulinemic euglycemic clamp technique J IA Weiping ,CHEN Lei ,XI 2A N G Kunsan ,et al.Department of Endocrinology and Metabolism ,S hanghai Diabetes Institute ,S hanghai Sixth People Hospital ,S hanghai 200233【Abstract 】 Objective To establish an extended hyperinsulinemic euglycemic clamp for the study of in 2sulin sensitivity in Chinese.Methods C ombining glucose clamp ,323H labelled glucose tracer technique and indirect calorimetry ,an extended hyperinsulinemic euglycemic clamp technique was applied into the study of methodology in 9normal weight subjects with normal glucose tolerance.R esults (1)When a higher level of insulin was created during maintaining euglycemia ,hepatic glucose production was completely inhibited ,and the counter 2regulatory hormones (including cortisol ,growth hormone and glucagon )and endogenous insulin secretion were not significantly stimulated.(2)During the steady 2state of the extended hyperinsulinemic eug 2lycemic clamp ,the insulin 2mediated glucose disappearance rate was significantly increased compared with basal state 〔(5.86±0.65)mg ・kg -1・min -1vs (2.45±0.15)mg ・kg -1・min -1,P <0.01〕,predominately by glycogen synthesis.And also ,the release of free fatty acid was remarkably inhibited with significant decrease of lipid oxidation.Conclusion The extended hyperinsulinemic euglycemic clamp technique is successfully es 2tablished in Chinese.During the steady 2state of exogenous insulin and glucose metabolism ,glucose metabolism and glucose utilization increased ,while the lipid catabolism decreased.【K ey w ords 】 G lucose clamp technique ;Extended hyperinsulinemic euglycemic clamp technique ;Metabolism(Chin J Endocrinol Metab ,2001,17:2682271) 高胰岛素2正葡萄糖钳夹技术具有稳态、定量、重复性好,精确测定外周组织胰岛素敏感性的优点,缺点是不能提供内源性葡萄糖(即肝糖)产生以及葡萄糖在细胞内利用的情况。
在应用葡萄糖钳夹技术的基础上,近年来联合同位素稀释追踪及间接测热技术〔1,2〕,全面了解机体葡萄糖的生成及利用,这三法联合应用称之为扩展高胰岛素2正葡萄糖钳夹技术〔3〕。
目前国际上已应用这项综合技术进行不同病理生理状态的研究,尤其在胰岛素抵抗相关疾病(肥胖、2型糖尿病、高血压)方面,对于研究胰岛素抵抗程度及机制,阐明药物或非药物措施对胰岛素敏感性的影响及作用机制有独到之处。
为此在国内建立并开展这项技术有重要意义。
对象和方法一、对象9例正常体重的上海地区中国人,男性4例,女性5例,年龄(47.0±2.8)岁。
研究对象均排除糖尿病、糖耐量减退、肝、肾疾病,未使用任何影响胰岛素敏感性药物。
试验前3天,研究对象每日碳水化合物饮食不少于200g,维持体重稳定。
试验前,将试验的性质、目的以及可能产生的不良反应告知研究对象,并填写知情同意书。
二、方法由高胰岛素2正葡萄糖钳夹、323H标记葡萄糖示踪和间接测热法三部分组成〔1,2〕。
受试对象空腹12小时,早晨8:00到实验室,测定身高、体重并排空小便后,仰卧。
分别在双前臂头静脉或正中静脉穿刺并留置导管以0.9%NaCl液维持静脉通道,以备抽血及输注各种试验用液。
整个实验是在研究对象清醒安静状态下进行(实验流程图见图1)。
图1 扩展高胰岛素2正葡萄糖钳夹试验流程图Fig1 The extended hyperinsulinemic euglycemic clamp pro2 cedures1.323H标记葡萄糖示踪技术:根据同位素标记葡萄糖的去向评估机体内源性葡萄糖生成率。
用于计算内源性葡萄糖(主要是肝糖)产生和葡萄糖消失率。
323H标记葡萄糖液(美国Amersham公司,比活性16.8Ci/mmol,纯度99.7%)输注总量为100μCi。
初始剂量25μCi,5分钟内注入,随后用注射泵以0.25μCi/min速率持续输注,共5小时。
2.高胰岛素2正葡萄糖钳夹(共150分钟):在323H标记葡萄糖示踪技术开始120分钟后进行高胰岛素2正葡萄糖钳夹试验(日本Terumo公司STC2 508型输液泵及STC2527微量输注泵)。
此时取血标本一侧前臂应置于恒温仪中(温度50℃)以保证静脉血动脉化。
在钳夹开始10分钟内输注人胰岛素溶液(丹麦Novo公司人正规胰岛素,40U/ml)使血浆胰岛素水平迅速升高。
随后140分钟内以40 mU・m-2・min-1速率持续输注。
在此期间,每5分钟测定一次动脉化的静脉血葡萄糖(Beckman6517型葡萄糖测定仪),输注并调整20%葡萄糖液输注率,使钳夹血糖值接近研究对象正常空腹血糖值,通常设置在4.4～5.0mmol/L,并记录调整时间。
钳夹期间每10分钟取血测定血浆葡萄糖比活性和胰岛素,每30分钟取血标本测C肽、皮质醇、生长激素、胰高血糖素和游离脂肪酸。
所有血样均经离心分离血清或血浆,-70℃保存至测定。
3.间接测热法(美国Sensormedics公司Vmax29型间接测热仪):通过测定受试者O2和CO2的交换,了解底物(糖、脂肪、蛋白质)氧化及非氧化的情况。
本研究主要用于测定葡萄糖在细胞内氧化和非氧化的量。
在钳夹前30分钟和钳夹第120～150分钟,测定基础状态和高胰岛素正葡萄糖钳夹稳定状态下的糖、脂代谢情况。
4.收集实验期间的尿标本,测定尿糖,以监测有无尿糖排泄,测定尿素氮,以估测机体蛋白质代谢。
5.糖、脂及激素测定:血浆葡萄糖(葡萄糖氧化酶法,美国Beckman公司);血浆323H葡萄糖比活性测定(液体闪烁测量技术);血胰岛素(放免法,华西糖尿病研究所);C肽、皮质醇、生长激素、胰高血糖素(放免法,美国DPC公司);血游离脂肪酸浓度(酶标比色法,日本和光制药株氏会社);尿糖(氧化酶法);尿素氮(尿素酶法)。
6.计算方法〔1〕:(1)应用Steele公式计算钳夹过程每10分钟的平均葡萄糖输注率、葡萄糖空间校正值、血浆葡萄糖显现率(glucose appearance rate, Ra)、血浆葡萄糖消失率(glucose disappearance rate, Rd,又称葡萄糖利用率)。
总葡萄糖利用率以钳夹开始40分钟至150分钟的平均Rd值表示。
胰岛素2葡萄糖代谢稳定状态(钳夹稳态期)指高胰岛素稳定状态下,葡萄糖输注率变化最小的期间,通常为钳夹120分钟～150分钟。
(2)肝糖产生量(hepatic glu2 cose production,HGP):基础肝糖产生等于323H葡萄糖的输注率(cpm/min)除以钳夹前30分钟稳定期内的平均血浆葡萄糖比活性(cpm/mg);在空腹状态下,血糖浓度相对恒定,内源性葡萄糖产生(即Ra)相等于Rd。
高胰岛素2正葡萄糖钳夹稳定状态下肝糖产生=Ra-葡萄糖输注率-葡萄糖空间校正值。
(3)葡萄糖在细胞内的代谢途径及代谢量:利用间接测热法得出葡萄糖氧化率,而葡萄糖非氧化率(即糖原合成率)是Rd与葡萄糖氧化率的差值。