（3）设计靶向转录起始区的人工锌 指蛋白，阻断或抑制转录起始复合 物的装配； （4）靶向目的基因转录增强子结合 的区域设计的锌指蛋白，从而抑制 基因的转录。
人工转录激活子
主要通过以下两种方式实现： （1）锌指与转录激活结构域连接形成 融合蛋白，通过促进转录复合物的装 配激活基因的转录。 （2）通过与转录抑制子对基因上游结 合的竞争，从而激活基因的转录。
锌指蛋白的设计 与利用
生物技术三班 蒋新培
邮箱构域：
DNA结合结构域和效应结构域。DNA结合结构域主要 采用对DNA序列特异识别]结合的C2H2型锌指结构域， 而功能结构域常常采用某些转录激活结构域、转录抑 制结构域或某些酶的活性结构域。这样进行设计的锌 指蛋白就可以在特定的核酸序列上行使相应的功能， 这对于目的基因的表达调控及蛋白质与核酸的相互作 用研究提供了新的思路。

锌指蛋白
• 2－13个手指，各由23氨基酸组成，并 由7－8个氨基酸连接；与 DNA大沟结 合并环绕DNA分子，大沟与特异DNA碱 基互作。 • 锌指蛋白大多都是与基因表达的调控有 关的功能蛋白。
锌指的设计筛选
在锌指结构中，只有α-螺旋中的几个氨基酸
残基对DNA的特异性识别有作用。因此通过 构建锌指的噬菌体展示库，从中可筛选与特 定DNA序列有高特异性与高度和力的锌指。 Rebar和Choo就分别建立了鼠转录因子 Zif268的第二个锌指结构中α-螺旋残基的随机 肽展示库[4，5]。，用随机三联体碱基进行三 轮筛选，得到了与不同三连体碱基对相应结 合的64个锌指序列，结果发现：α-螺旋的三 个主要位（-1、+3、+6位）和一个辅助位+2 位与DNA的识别密切相关。
人工锌指蛋白的应用
• （1）人工设计的转录抑制 • （2）转录激活子 • （3）人工限制性内切酶
人工设计的转录抑制子
人工设计的锌指蛋白可以通过以下方式抑 制基因的转录：


（1）特异性的锌指与转录抑制结构 域相连形成的融合蛋白。 （2）设计靶向转录区域的锌指蛋 白，抑制转录的延伸；
人工设计的转录抑制子

Zif268
Zif268是Milbrandt及Lim等分别于 1987年克隆发现的. 其包括一内含 子序列和两个外显子序列，基因全 长为3.8 kb. Zif268编码一分子质 量为61 ku的蛋白质Zif268.
锌指的设计筛选
Isalan等又建立起一种非常快速和简便的方 法称之为两部分法。以Zif268的三个锌指为 基本框架，把三个锌指拆分成两部分，建 立了两个噬菌体展示库。从两个库中筛选 出对HIV-1的-80位到+60位启动子序列特异 性特别的7个三锌指，并据此设计了7个三 锌指肽，研究表明，这7个锌指肽与对应的 DNA序列有很好的亲和力与特异性。
人工限制性内切酶

把多个锌指与限制性内切酶的切割结 构域相连，可以设计人工限制限制性 内切酶，研究表明构建人工限制性酶 用以切开特定序列DNA双链是可行的 。
展望
• C2H2型锌指为DNA序列特异性锌指蛋 白的设计提供了一个很好的框架，通过 噬菌体展示技术和计算机结构模式以及 锌指连接区的设计可筛选设计出于任意 DNA序列特异性结合的锌指，若连上功 能结构域可作为基因的转录激因子或转 录抑制因子或作用于DNA的酶。
主要内容
锌指结构
锌指的设计筛选 多锌指之间连接区的设计 人工锌指蛋白的应用 展望

锌指结构
• 具有重复结构的氨基酸模式，每个重复的 “指”状结构约含23个氨基酸残基，锌以4 个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸 和2个组氨酸相结合。 • 相隔特定距离的半胱氨酸结合锌指，能与 某些RNA/DNA 结合。
锌指结构
在1989年Lee等揭示锌指立体结构具有保守 型，每个锌指均是由1对反平行的β折叠和一 个α螺旋组成，每一个锌指结构都形成独立的 包含锌原子的小结构域,它通过2个保守的His 和2个Cys螯合一个锌因子,从而使结构更加 稳定。 锌指结构的共同特征是通过肽链中氨基酸残 基的特征集团与Zn2+的结合来稳定一种很短 的，可自我折叠成“手指”形状的的多肽空 间构型。
该方法充分考虑到第二个锌指的α-螺旋的第 2位氨基酸残基与第一个锌指α-螺旋的第6 位对DNA的识别有协同作用。
多锌指之间连接区的设计

（1）采用具有柔韧性的连接区，使锌指对所 结合DNA亲和力与特异性有所提高 。 （2）把天然转录因子的二聚化区域作为连接 区。

总之设计多锌指蛋白时应考虑到锌指之间的连 接区，这对于锌指蛋白对所结合DNA特异性与 亲和力是重要的。