生物化学实验报告姓名：张子荣学号： 3150901080专业年级： 2015级临床医学组别：第五实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖元的提取，鉴定和定量检测实验日期2016.12.29 实验地点第五实验室合作者张林燕指导老师何肖娟评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。

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一、实验目的1.掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

3.正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。

4.熟练运用溶液混匀的各种方法。

5.正确掌握溶液转移的操作。

6.正确操作使用分光光度计。

二、实验原理1.肝糖原的提取糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。

糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。

2.糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。

这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。

糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。

CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4+ Cu(OH)22Cu(OH)2 + C6H12O6= 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O2CuOH = H20 + Cu2O (红色)Cu(OH)2 ==== H2O + CuO (黑色)3.肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。

该物质在620nm 处有最大吸收。

糖含量在10—100mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。

利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。

糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。

三、材料与方法：以流程图示意仪器及试剂：1.仪器：（1）普通离心机，室温-100℃恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为 10mg级电子天平（2）剪刀、镊子、研钵（3）试管架，离心管，试管（4）刻度吸量管（2ml ,5ml），1000μl微量可调取液器（5）100ml容量瓶（6）白瓷反应板2.试剂：鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）蒽酮显色剂实验方法及步骤：1.肝糖原的提取鸡肝约1.5 g，剪碎COOH 1 ml＋5%CCl3研磨至乳状COOH 3 ml＋5%CCl3研磨成肝匀浆3分钟（4000 r / min）3.5-3.8ml）＋等量的95%乙醇，混匀，静置10分钟分钟（4000 r / min）＋蒸镏水1 ml沸水浴2分钟，溶解沉淀白瓷板孔穴中糖原溶液1ml＋浓HCl 5滴（250微升）加碘试剂2沸水浴糖原溶液2滴滴（250微升）呈色对比＋班氏试剂4滴（200微升）沸水浴2分钟，观察变化注意事项：1、提取肝糖原时，向上清液中加入等量的95%乙醇后，必须混匀。

由于上清液为水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。

加之上清液已4ml多，加上等量乙醇，总量接近9ml，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。

2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。

葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。

淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。

3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。

2.肝糖原定量测定鸡肝 0.15 g+30% KOH 1.5ml沸水浴15min冷却，全部转入100ml 容量瓶中加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液取3支干净的试管，按下表操作：试剂（ml ）空白管 标准管 样品管 蒸馏水1.0 —— —— 标准葡萄糖溶液—— 1.0 —— 糖原提取液—— —— 1.0 0.2%蒽酮溶液2.5 2.5 2.5混匀，沸水浴10min ，冷却。

在722型或721型分光光度计620nm 波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A ）.计算：肝糖原（g/100g 肝组织）=标准测定A A X 0.05 X ）肝组织重（g 100 X 1000100 X 1.11 注：由于我们组样品是稀释2倍的，所以后来结果要X 稀释倍数四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

（一）实验现象以及数据：实验一：肝糖原提取，鉴定实验1. 当把1.5g 的鸡肝加入1ml5%的CCl 3COOH 研磨至乳状，在加入3ml5%的CCl 3COOH 研磨至肝匀浆转入试管后，可以发现试管液呈现乳黄色浑浊。

2. 加入离心管离心三分钟后，试管形成三个层，由上到下分别是：乳黄色的固体层（脂肪脂质等物质）；稍微浑浊呈白色的溶液层；乳黄色固体层3. 吸取上图中的溶液层溶液加入等量乙醇溶解再次离心后，可以看见此次的溶液形成乳白色沉淀，而且相比于第一次离心，此次离心形成的液体更加澄清。

脂肪等物质溶液不溶性杂质等物质4. 沉淀加蒸馏水溶解，沸水浴后形成乳白色溶液。

5. 在呈色对比反应中，加入糖原溶液的呈现红褐色。

6. 取充分水解后的糖原水解液2滴与班氏试剂均匀，沸水浴2分钟后，使溶液变为砖对照组，2滴碘试剂上清液沉淀红色。

实验二：肝糖原定量实验1.0.15g的鸡肝加入KOH溶液后并没有明显的变化，鸡肝仅微量溶解；2.100摄氏度水浴10分钟后可以看见鸡肝大量溶于KOH，呈现的深橘黄色浑浊溶液，但是也有少量的组织并没有溶解，而是悬浮状态，没有像其他组那样出现明显的分层现象；3. 在转入100ml 容量瓶时，可以发现一开始含有样品的溶液呈现深橘黄色，随着不断地加水润洗，溶液颜色由深橘黄色变为浅黄色，最后变为浅白色。

4. 在最后进行糖原的测定时，在用刻度吸管加入2.5ml 的蒽酮溶液时，空白管剧烈发烫，溶液颜色逐渐变为黄色；标准管的颜色由无色变为绿色，试管发烫；样品管的颜色由原来的轻微白色逐渐变为深绿色甚至有点偏蓝的趋势。

由于样品管糖原浓度过高，所以按照方法稀释2倍后，进行了10分钟的100摄氏度水浴保温，得到的实验结果如下：空白管（水浴后） 标准管（水浴后） 样品管（稀释2倍后水浴） 样品管（未稀释未水浴） 浅黄色 绿色 深绿色 浅蓝5.将空白管在620nm 处的A 值设定为0，测得标准管、样品管的A 值如下： 鸡肝漂浮物不分层的橘黄色溶液编号空白管 标准管 样品管（稀释2倍） 10 0.585 0.696 20 0.586 0.686 30 0.586 0.678 平均值 0 0.586 0.687肝糖原（g/100g 肝组织）=标准测定A A X 0.05 X ）肝组织重（g 100 X 1000100 X 1.11 X 稀释倍数（二）结果以及讨论： 由以上数据可以得知，稀释2倍后的样品液A 值为0.687，标准管为0.586，由以上公式计算：肝糖原（g/100g 肝组织）=0.5860.687 X 0.05 X 0.15100 X 1000100 X 1.11 X 2 ≈ 8.675（g/100g ）分析以及结果讨论：1.在鸡肝糖原的定性分析中，即①呈色反应中，样品溶液加入碘试剂后呈现明显的红褐色，说明样品液含有糖原； ②在样品液水解液与班氏试剂反应中，使溶液呈现砖红色；说明水解液含有葡萄糖（还原性糖）综上，鸡肝中含有丰富的糖原。

2.在鸡肝糖原的定量实验中，我们组所得的肝糖原含量实验数据为8.675g/100g ，而正常情况下为2-3g/100g ，明显偏高。

但在操作过程中称量0.15g 鸡肝，加入KOH,水浴，加入蒽酮（换用加样枪结果依旧）均不存在操作问题，所以造成此结果的原因可能是： ①实验所用的鸡处于饱食状态，糖原大量储存缓解血糖浓度，因此使肝中的糖原明显多于一般情况下的鸡糖原含量；②试剂误差：实验所用的试管可能由于上一组没有清洗干净，造成了部分糖原残留在试管导致我们组的结果偏高；另外，100ml容量瓶中含有少量白色固体难以清洗干净，也有可能是上一组留下的糖原未清洗干净。

所以致使糖原测得值较高；。