蛋白质晶体学的发展和应用摘要: 从50年前英国科学家解析出第一个蛋白质晶体结构以来, 蛋白质晶体学历经数个里程碑式的发展,已经成为一门成熟的高科技学科, 是结构生物学的主要研究手段。

近年来结构生物学发展迅速并和其他学科相互渗透交叉, 特别是受到结构基因组学等热点学科的极大带动。

作为结构生物学的基本手段和技术, 蛋白质晶体学从解析简单的蛋白质三维结构延伸到解决各类生物大分子及复合物结构, 并更加注重研究结构与功能之间的相互关系, 派生出诸如基于结构的药物设计等应用性很强的分支。

生物技术及计算机技术的飞速发展, 尤其是高通量技术在生物学领域的应用, 为蛋白质晶体学带来了全新的概念和更加广阔的前景。

文章将主要介绍蛋白质晶体学技术的一些历史发展以及应用。

1 引言蛋白质晶体学（或称蛋白晶体学）是进行生物大分子结构研究的通称，是结构生物学的一个重要组成部分。

它利用x射线穿过晶体发生的衍射现象与晶胞内原子的空间位置有密切的关系, 以数学物理方法可从晶体的衍射象推引出分子的真实象。

由于x光的波长很短(用于结构分析的一般是1.54Å), 而蛋白质分子内大多数原子间的距离都在1.5 Å入左右, 故这一技术成象的分辨率可以超过看清原子的水平, 而且是三维实体。

蛋白质是由α—氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。

蛋白质是构成人体组织器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用。

蛋白质有着复杂的空间结构。

α—氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，构成蛋白质的一级结构。

在一级结构的基础上，氨基酸多肽链在进一步折叠形成一定的二级结构，如α螺旋和β折叠等。

在二级结构或者超二级结构甚至结构域的基础上，进一步盘绕，折叠，依靠共价键的维系固定所形成的特定空间结构成为蛋白质的三级结构。

在体内有许多蛋白质含有2条或2条以上多肽链，才能全面地执行功能。

每一条多肽链都有其完整的三级结构，称为亚基（subunit），亚基与亚基之间呈特定的三维空间分布，并以非共价键相链接，这种蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。

蛋白质的复杂结构是其功能多样性的前提和基础。

大部分蛋白质都要保持其空间结构的完整性，才能体现生物活性并行使其特有的生物学功能。

因此，研究蛋白质的空间结构对酶反应机理或蛋白质- 蛋白质相互作用方面以及进行药物设计和优化都有着极其重要的作用。

2 .蛋白质晶体学的发展早在1953 年，在剑桥大学卡文迪许实验室学习和工作的佩如兹、坎德鲁的博士研究生和博士后沃森（Watson）和克里克（Crick）利用富兰克林（Franklin）的X 射线衍射数据提供的晶体信息，结合结构化学模型构建，提出了举世闻名的DNA双螺旋结构模型，这是利用X 射线晶体学技术解析生物大分子结构的又一个里程碑式的成果，为现代分子生物学的确立奠定了结构基础。

在上世纪30 年代，多萝思·霍奇金和她的导师伯纳尔（Bernal）以及剑桥大学的佩如兹已经得到蛋白质晶体的高分辨率X射线衍射数据，然而一直到二次世界大战后的1957 年和1959 年，才由佩如兹和坎德鲁（John Kendrew）发展出新的方法，分别解析得到肌红蛋白和血红蛋白的三维结构，第一次准确测定出蛋白质这种生物大分子的三维结构。

在随后的30 多年里，蛋白质晶体学稳健发展，方法学趋于成熟，主要的仪器设备以及计算机软件都已市场化，解析的蛋白质结构数目也逐年增长，这主要受到来自三个方面的巨大推动，它们是：1) DNA 重组技术与蛋白质纯化以及晶体筛选技术的发展；2) 同步辐射光源与高效、高速探测器的发明；3) 计算机运行速度的大幅度提高及晶体学计算程序的快速发展。

现分别略述如下：2.1 蛋白质表达、纯化和晶体筛选的发展研究蛋白质的晶体结构，首先需要获得高纯度、高均一性的蛋白质样品。

在基因重组技术应用以前，蛋白质晶体学研究所需要的蛋白子主要是从生物原材料中提取，工作量巨大，纯化周期长，效率低。

同时，大部分的蛋白质，尤其是具有生物催化活性的酶分子，很容易失去活性。

在复杂的纯化过程中，会有大量蛋白的损失。

这就大大的增加了从原始生物材料中提取蛋白质难度。

利用DNA重组技术使得在大肠杆菌或其他宿主细胞中大量表达、纯化所需要的目的蛋白成为可能。

首先将目的蛋白的基因出来，与带有标签的质粒构建成重组质粒，转入宿主菌中（一般是大肠杆菌），让其大量扩增和表达。

表达出来的蛋白，带有特定的标签，而这种标签一般不会影响蛋白质的活性功能。

下一步利用亲和层析技术即可将目的蛋白进行快速、有效和大量的纯化制备。

现代生物技术及仪器的进步与应用使得规模化、高通量化、成千上万地克隆基因成为可能。

随着更多自动化技术与仪器的出现，大规模地克隆基因、快速纯化蛋白、高通量自动化地筛选蛋白质晶体生长条件是蛋白质晶体学发展的必然。

20 世纪90 年代以前，蛋白质晶体的筛选及培养基本没有章法，主要凭经验在硫酸铵等高盐溶液中获得蛋白质晶体。

90 年代以后，很多人开始对蛋白质结晶条件进行系统分析，提出了多套随机多组分网格筛选条件。

目前，市面上已经可以买到成百上千种蛋白质晶体筛选条件，各种高通量、自动化晶体筛选系统、晶体生长观测系统也应运而生。

可以预料，随着结构基因组学的出现及发展，大规模化、自动化仪器必将更加快速地发展和普及。

2.2 同步辐射光源在蛋白质晶体学方面的应用室内光源是利用金属靶（铜靶最常用于蛋白晶体学）X射线装置作为激发源，通过高速阴极电子束打在阳极金属靶上激发出X 射线。

而同步辐射则是利用高能电子在同步加速器的强大磁场下运动改变方向时，发射出的很强的同步辐射电磁波。

与室内光源相比，同步辐射光源具有很多优点。

宽波段同步辐射光的波长覆盖面大，具有从远红外、可见光、紫外直到X射线范围内的连续光谱，并且能根据使用者的需要获得特定波长的光。

高准直同步辐射光的发射集中在以电子运动方向为中心的一个很窄的圆锥内，张角非常小，几乎是平行光束，堪与激光媲美。

高偏振从偏转磁铁引出的同步辐射光在电子轨道平面上是完全的线偏振光，此外，可以从特殊设计的插入件得到任意偏振状态的光。

高纯净与高亮度高纯净：同步辐射光是在超高真空中产生的，不存在任何由杂质带来的污染，是非常纯净的光。

高亮度：同步辐射光源是高强度光源，有很高的辐射功率和功率密度，第三代同步辐射光源的 X射线亮度是 X光机的上千亿倍。

窄脉冲同步辐射光是脉冲光，有优良的脉冲时间结构，其宽度在10-11~10-8秒(几十皮秒至几十纳秒)之间可调，脉冲之间的间隔为几十纳秒至微秒量级，这种特性对“变化过程”的研究非常有用，如化学反应过程、生命过程、材料结构变化过程和环境污染微观过程等。

可精确预知同步辐射光的光子通量、角分布和能谱等均可精确计算，因此它可以作为辐射计量———特别是真空紫外到 X射线波段计量———的标准光源。

此外，同步辐射光还具有高度稳定性、高通量、微束径、准相干等独特而优异的性能。

2.3 晶体结构解析方法和计算机的发展目前，常用于晶体结构解析的方法包括分子置换法（MR）、单/ 多波长异常散射法（SAD/MAD）和单/ 多对同晶置换法（SIR/MIR）及其结合的方法，如SIRAS/MIRAS。

如果所研究蛋白质的同源物的结构已知，可以利用该结构作为搜索模型，通过MR 方法生成相位，这通常需要被研究的蛋白质与其同源物有30%以上的序列等同性，MR 方法对于分子量较大的蛋白质成功率较高。

MR 方法仅需一套数据，对数据完整度要求比较高，初始相位的偏差与采用的模型有关。

近年来，越来越多的蛋白质结构被解析并提交到PDB 数据库，许多蛋白质在该数据库中都能找到同源结构存在，也就是说可以通过MR方法解析结构。

MAD 方法利用重原子尤其是Se（硒）在不同波长的异常散射信号的差异计算衍射相位。

一般要在表达蛋白阶段将Met （甲硫氨酸）中的S （硫）原子置换为Se，制备含有Se 原子的蛋白样品并且得到晶体，而且通常需要光源的波长是可调的，这正好符合同步辐射光源特性。

从计算及结构显示程序的发展来看，上世纪70 年代流行的FFT （FastFourier Transform）算法和高速计算机的发展大大提高了计算能力并缩短了计算时间，使得程序的发展成为可能。

从70 年代末期开始，威尔士人Alwyn Jones 在德国马普生化研究所开始考虑用计算机辅助显示蛋白质结构，利用计算机图形学研究的最新成果设计出了结构显示软件Frodo，开创了计算机结合晶体学显示蛋白质结构的先河。

Frodo 经过了不同版本的演变，发展到全新程序O。

常用的有更新版CCP4 （CCP4i）、ARP/wARP、Solve/Resolve、Shelx、SHARP/AutoSHARP、CNS(X-PLOR 更新版)、Phenix 和BnP 等软件包，还有衍射数据处理程序如DENZO、XDS、HKL2000等，以及一些独立的程序或工具。

不仅如此，许多程序，如SHARP、OASIS、RESOLVE，还可以利用已有部分模型的结果提高相位的准确性，可与模型搭建迭代循环进行。

另外，图形软件Coot 和Pymol 可分别用来进行结构精修和分析3.应用方面蛋白质晶体学在应用方面具有巨大的潜力，这里主要略述以下几点：1) 蛋白质功能研究在原子及电子传递层次，酶反应机理或蛋白质- 蛋白质相互作用方面，蛋白质结构的经典意义是深入理解其功能。

随着越来越多复杂大分子复合物及膜蛋白晶体结构的解析，我们必将更加广泛和深刻地理解生物学功能及生物界的起源、发生和发展规律。

2) 基于结构的药物设计根据已知蛋白质结构进行药物设计和优化，这种方法已经被广泛用于目标蛋白的选取和药物的前期研发，并已成功研制出一些药物用于临床治疗。

大量蛋白质结构的解析，尤其是蛋白激酶和具有重要功能的膜蛋白（如GPCR 等）的结构分析，将为基于结构的药物设计提供更多的工作靶标。

此外，这些蛋白质或其晶体可用于Fragment 小分子的共结晶或浸泡筛选，它们复合物的晶体结构将为药物的优化提供数据支持。

3) 蛋白质工程通过对野生型及不同突变体的空间结构的研究。

根据需要对蛋白质进行改造，设计活性更高或具有其他功能特性的蛋白质分子。

尤其是对于具有某一功能的家族的蛋白质结构研究分析，对于更好地理解结构和功能的关系是十分重要的。

同时大量实验数据的积累将为基于结构的预测分析提供必要的理论依据。

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