2010No．5Serial No．218China BrewingFPA 分别达到7105.92U/g 和1463.97U/g 。

参考文献：[1]李亚澜，张建强.纤维素高效降解菌的分离鉴定及固态发酵条件的研究[D].西南交通大学硕士论文，2005.[2]姜绪林，张星元.绿色木霉固态发酵产纤维素酶的研究[D].江南大学硕士论文，2005.[3]马旭光，张宗舟，刘星斌.航天诱变黑曲霉菌株ZM-8产纤维素酶的固态发酵条件研究[J].中国酿造，2008（23）：37-40.[4]邬敏辰，李江华.里氏木霉固体发酵生产纤维素的研究[J].江苏食品与发酵，1998（2）：2-6.[5]GHOSE T K.Measurement of cellulose activities[J].Pure and ApplyChem,1987,58(2):257-268.[6]范艳丽，邵林广.纤维素降解菌的筛选及特性研究[D].武汉科技大学硕士论文，2004.[7]王艳昆，张建强.纤维素高效降解混合菌的筛选及其糖化发酵条件研究[D].西南交通大学硕士论文，2007.乳酸菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称[1]。

普通乳酸菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等）不易存活，不能耐受强酸、强碱和高温，不是理想的微生物制剂。

于是，寻找一种抗逆性强的乳酸菌便成了研究的重点。

其中最突出的是凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans ），1989年美国FDA 公布的41种可用于饲料的安全菌株及1992年再次批准42种中包括的5种芽孢杆菌中，凝结芽孢杆菌排在第一位，其是一种可以产生乳酸的芽孢杆菌，兼具芽孢杆菌和乳酸菌的优点，且抗逆性强，能调节动物肠道微生态平衡，促进动物消化和提高动物免疫力等，现已应用于饲料工业中[2-3]。

由于最终制成的菌剂要有芽孢的形式才具有高抗性，芽孢没有新陈代谢，能耐热、紫外线、多种溶剂、酸、碱等，是较为理想的微生物制剂[4]。

试验主要通过摇瓶液体发酵，优化培养基及培养条件来提高凝结芽孢杆菌菌液中芽孢数，为后期的加工制成高效的凝结芽孢杆菌制剂打下良好的基础。

1材料与检验方法1.1试验材料菌种：凝结芽孢杆菌F5（华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保存）。

培养基：YPD 培养基：葡萄糖20g ，胰蛋白胨20g ，酵母粉10g ，水1000mL ；调pH 值为7.0，115℃灭菌20min 。

为菌种活化时用。

1.2方法1.2.1菌种活化将保存的凝结芽孢杆菌转接到YPD 试管斜面培养基中，40℃培养24h ，备用。

1.2.2活菌计数法活菌总数测定采用稀释平板计数法[5]，芽孢计数法是把菌液80℃水浴10min 后稀释平板计数。

1.2.3种子液的制备取1环活化的菌种，接入装有50mL YPD 液体培养基一株凝结芽孢杆菌产芽孢条件的研究杨立华，赵述淼，冷一非，梁运祥*（华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070）摘要：通过培养基组成正交试验及培养条件单因素试验，对一株凝结芽孢杆菌的产芽孢条件进行了优化，优化后的培养基组成（质量分数）为酵母粉3g/L ，蛋白胨5g/L ，牛肉膏2g/L ，MnSO 40.005g/L ，NaCl 2g/L ，K 2HPO 43g/L ，MgSO 40.02g/L 。

最优的培养条件为温度40℃，初始pH 值为7.0，转速210r/min ，装液量为250mL 的三角瓶装30mL ，接种量为6%（v/v ），发酵时间为48h 。

最终的芽孢数为9.1×108cfu/mL 。

关键词：凝结芽孢杆菌；芽孢形成；培养条件；优化中图分类号：Q93-335文献标识码：A文章编号：0254-5071（2010）05-0096-03Spore-forming conditions of Bacillus coagulansYANG Lihua,ZHAO Shumiao,LENG Yifei,LIANG Yunxiang*(State Key Laboratory of Agromicrobiology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)Abstract:The optimal conditions of spore-forming by Bacillus coagulan were investigated using the single factor and orthogonal tests in this paper.The optimal medium were as follows :yeast extract 3g/L,peptone 5g/L,beef extract 2g/L,MnSO 40.005g/L,NaCl 2g/L,K 2HPO 43g/L and MgSO 40.02g/L.The optimal culture conditions were obtained by single-factor test as follows:temperature 40℃,initial pH 7.0,rotation speed 210r/mim,volume of shaking flask 30ml/250ml,and fementation time 48h.Under these conditions,the number of spore reached 9.1×108cfu/ml.Key words ：Bacillus coagulans ;sporulation;culture conditions;optimization收稿日期：2009-12-26作者简介：杨立华（1985-）,女，湖北黄冈人，硕士研究生，研究方向为发酵工程；梁运祥*，教授，通讯作者。

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Research Report96··中国酿造2010年第5期总第218期的250mL 三角瓶中，40℃、180r/min 培养18h 。

1.2.4芽孢率的判定[6]芽孢率是活菌计数法得到的芽孢数和总菌数的百分比。

1.2.5正交试验在培养基单因素试验的基础上做7因素（酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、MnSO 4、NaCl 、K 2HPO 4、MgSO 4）2水平正交试验[7-8]。

1.2.6培养条件的优化采用最优培养基配方，固定摇瓶培养的条件后，对最佳发酵时间、温度、初始pH 值、接种量、装液量进行逐一优化。

2结果与分析2.1正交试验（见附表）由附表可以看出，各因素主次为MnSO 4＞酵母粉＞NaCl ＞试验号AMnSO 4/（g ·L -1）BNaCl/（g ·L -1）C 酵母粉/（g ·L -1）D 蛋白胨/（g ·L -1）E 牛肉膏/（g ·L -1）FK 2HPO 4/（g ·L -1）GMgSO 4/（g ·L -1）总菌数/（×108cfu ·mL -1）芽孢数/（×108cfu ·mL -1）芽孢率/%11（0.005）1（2）1（5）1（2）1（1）1（0.02）1 5.0 4.69221112（10）2（3）2（2）212.0 3.220312（6）2（10）112212.5 2.7204122221117.40052（0.5）1212128.3006212212117.2 1.53107221122112.2 1.531582212112 6.40.35K 1 2.625 2.333 2.408 2.208 2.283 1.225 1.915K 20.840 1.13 1.058 1.258 1.183 2.240 1.550R1.7851.201.3500.9501.1001.0150.365附表发酵培养基正交试验结果与分析Attached table.Results of orthogonal test for fermentation medium牛肉膏＞KH 2PO 4＞蛋白胨＞MgSO 4；最优组合为A 1B 1C 1D 1E 1F 2G 1，即酵母粉3g/L ，蛋白胨5g/L ，牛肉膏2g/L ，MnSO 40.005g/L ，NaCl 2g/L ，K 2HPO 43g/L ，MgSO 40.02g/L 。

2.2培养条件的研究把上述正交试验最优组合的作为研究培养条件的基础培养基，在此基础上研究不同培养条件对芽孢数的影响。

起初的培养条件为初始pH7.0，250mL 三角瓶装液量50mL ，培养温度40℃，180r/min 摇床培养48h ，接种量2%（v/v ）。

2.2.1不同初始pH 值对芽孢生长的影响分别设定发酵培养基的初始pH 值为6.5、6.8、7.0、7.2、7.5。

250mL 三角瓶装液量50mL ，不同pH 值条件下总菌数、芽孢数的变化见附图A 。

由附图A 结果表明，总菌数、芽孢数随发酵培养基的初始pH 值增大，先增大后减小，在pH 值为7.0时总菌数、芽孢数均最大。

因此，选择发酵培养基的初始pH 值为7.0。

2.2.2不同培养温度对芽孢杆菌生长的影响分别使培养温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，经跟踪检测发现，30℃、35℃培养48h 后镜检发现无芽孢，全是营养体。

再将其一直培养至60h 、72h ，分别镜检，发现均无芽孢。

50℃培养48h 后镜检芽孢率近5%，且发现有自溶的现象。

对结果综合分析发现，45℃总菌数较高，为6.3×108cfu/mL ，40℃时总菌数为6×108cfu/mL ，但是芽孢率（65%）和芽孢数（5.0×108cfu/mL ），均不如40℃时的芽孢率（98%）和芽孢数（5.9×108cfu/mL ），故选择40℃为最佳培养温度。

2.2.3不同转速对芽孢杆菌生长的影响在温度40℃、装液量50mL 、pH 7.0，分别使转速为120r/min 、150r/min 、180r/min 、210r/min 、240r/min 。

培养48h 后分别取菌液镜检，并活菌计数。

其结果检附图B 。

由附图B 结果表明，当转速为210r/min 时，芽孢数最大，为6.5×108cfu/mL ，分别为转速为240r/min 时，总菌数为10.8×108cfu/mL ，但没产芽孢。

综合考虑，选择210r/min 为最佳摇床转速。