作者简介 ： 薛 原 （９ ８ ）女， １ ７ 一 ， 黑龙江饶河人 ， 讲师 ， 士， 博 主要从 事动物药理学与毒理学方面的研究． ｍ ｉ ｕ ｙａ－ ９ ８ ６ ． ｎ Ｅ ａ ｘ ｅ ｎ １７ ＠１３ ｏ — ｈ ｕ ｃ
中 图分 类 号 ：８２６ ＋ ￥５ ．１ ４ 文 献 标 志码 ：Ｂ 文章 编 号 ：０ ２ １５ （０ １０ — ０ １０ １ ０ — ９ ７２ １）３ ０ ７ — ２
氯霉素类 药物包括氯霉素 、 甲砜 霉素和氟苯 尼 的 片段 为 ３９ｂ ，ｍＡ 基 因 目的片 段 为 ６ ８ｂ 。 ９ ｐ ｃ ｌ ９ ｐ ．２ ２ Ｃ 考等。 此类药物抗菌谱广、 吸收快 、 内分布广泛 ， 体 在 １ ． 目的基 因序 列测 定 将 回收纯 化 的 Ｐ Ｒ产 兽医临床上发挥着 举足轻重 的作用 ，其 耐药性 也备 物与 Ｄ Ｄ ８ Ｔ载体进行连接反应后 ， Ｍ １一 转化大肠杆菌 受重视Ⅲ 因此 ， 。 本试验对 黑龙江省受试养殖场 ６ 株 Ｄ ５￣ ０ Ｈ ｃ感受态细胞 。碱裂解法提取质粒 ，经 Ｐ Ｒ初 Ｃ 临床分 离的猪源大肠杆 菌的 ｎ Ｒ和 ｃ Ａ基因进行 步 鉴 定 ，随 机选 取 ３ 阳性 质 粒委 托 北 京 六 合华 大 ｏ ｍｌ 个 分 子检 测 和 分 析 ， 旨在 为猪 源 大 肠 杆 菌 氯 霉 素 类 药 基 因科 技 股 份 有 限 公 司 进 行核 苷 酸 序 列 测 定 。 物耐药基 因的研究和分子流行病学调查提供试 验依 １ ． 目 的 基 因 序 列 分 析 首 先 利 用 Ｄ Ａ ｔ 中 ．３ ２ Ｎ Ｓｒ ａ 据 ，对临床 合理用药 以及控制细菌耐药性发展均具 ＭｅＡ ｉ ｇ ｌ ｎ软件 对测 定 的 目的基 因序 列进 行 比对分 ｇ 有重要意义。 析 ， 定 出 目 的基 因 的 优 势 序 列 ； 后 将 ｎ Ｒ 基 因 确 然 ｏ 的优势序列通过 Ｎ Ｂ 的 Ｂ Ａ Ｔ检索系统进行序列 ＣＩ ＬＳ １ 材 料 和方 法
１ 试 验 材料 ． １ １ ． 试 验 菌株 ．１ １
同源性 分析 。使用 Ｃｕｔ Ｘ ｌ ３软件与 从Ｇ ｎ ａ ｋ １ ａ ＿ ｓ１ ８ ｅＢ ｎ 药 敏质 控 菌 株 大肠 杆 菌 Ａ Ｃ 数据库中获得 的菌株序列进行多序列匹配 比对 。通 ＴＣ
２９ ２购 自中国兽医药品监察所 。 ５２ ， 试验用大肠杆菌， 过 Ｍｅａ． ｇ４ ０软件 采用 除权配对 法构建 系统进化树 ， ２１ ０ ０年 ５ １ 从 黑 龙 江 省 哈 尔 滨 市 周 边 地 区 ５ 采用 自举 分析进行置信度检测 。 — ２月 个规模化养殖场分离鉴定 出 ９ 株猪源大肠杆菌， ０ 随 ２ 结果 机选 取其 中 ６ 株 用于氯霉素类药物耐药基 因检测 。 ２１ ｃ Ａ、 ｏ ０ ． ｍｌ ｆ Ｒ基 因的检 测 结 果 ｌ １１ 药 品 普通琼脂、 ．２ ． 水解酪蛋 白琼脂培养基， 杭州 ６ 株猪源大肠杆菌 中，ｍ Ａ基因检 出的阳性数 ０ ｃｌ 天和微生物试剂有限公司生产；Ｍ ８Ｔ Ｄ Ｄ１－ 载体、ａ Ｄ Ａ Ｔｑ Ｎ 聚合酶、Ｎ Ｐ、ｕ ｅ Ｄ ００ ｒｅ等均为 Ｔ Ｋ Ｒ ｄ Ｔ ｓ ｆ ｒ Ｌ ｋｒ Ｂ 、 ５ ０ Ｍａ ａ ａａ 公司产品； Ｎ Ｄ Ａ胶回收试剂盒为 Ａ ｖｅ ｘｇｎ公司产品。 １ － 主要 仪 器 Ｐ Ｒ扩 增 仪 为德 国 Ｂｏ ｅ ａ 司 ．３ １ Ｃ ｉｍ ｒ 公 ｔ 产 品；凝胶 成像 分析系统 为美 国 Ａｐ ａｌ ｇｒ２ ０ １ ｈ ｍａｅ２ ０ 公司 产 品 。
２ １ 第 ３期 ０１
养 猪 Ｓ Ｎ Ｒ Ｄ ＴＯ ＷＩ Ｅ Ｐ Ｏ ＵＣ Ｉ Ｎ
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猪源大肠杆菌 中氯霉素类药 物耐药基 因的检测与分析
薛 原 陈建 飞。张 秀英 华育 平 ， ， ，
（． 北 林业 大 学野 生动 物 资源 学 院 ， 龙 江 哈 尔 滨 １０ ４ ； １ 东 黑 ５００ ２中国农业科学 院哈尔滨兽医研究所 ， ． 哈尔滨 １０ ０ ； ． ５ ０ １ ３东北农业大学动物医学学院， 哈尔滨 １０ ４ ） ５ ０ ０
１ ． 试 验 方 法 ２
为３ ０例 ，阳性率为 ５ ％加ｏ ０ Ｒ基因检出的阳性数 为 ４ 例 ，阳性率为 ８ ％。扩增 的 ｃ ｌ ｆ Ｒ基因片段 ８ ０ ｍ Ａ、０ ｌ 大 小与预期相符 ；部分菌株 的 目的基因扩 增结果如
图 １ 图 ２所 示 。 、
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
１ ． 目的基因扩增 Ｐ Ｒ扩增 的模板 为菌株质 粒 ．１ ２ Ｃ Ｄ Ａ和菌落。引物序列引 自参考文献ｆ 由上海英骏 Ｎ ２ ｉ ， 生物 技术有 限公司 合成 。采 用 ２ ＬＰ Ｒ扩增 体 ５Ｉ Ｃ ｘ 系 ： 板 ２ｔ ，Ｏ Ｂ ｆ ｒ ． Ｉ ，Ｎ Ｐ２ Ｉ ， 、 模 Ｌ ｌ ｘ ｕ ｅ ５ ｘ ｄ Ｔ Ｌ 上 下 ｘ ２ Ｌ ｘ 游 引 物 各 ０５ Ｌ Ｔ ｑＤ Ａ 聚 合 酶 ０２ Ｌ 加 灭 菌 ． ， ａ Ｎ ． ｕ， ５ 双蒸水至 ２ Ｌ 反应条件 ：４℃预变性 ５ｍ ｎ９ ５ 。 ９ ｉ；４℃ 变性 １ｍ ｎ 退 火 １ｍ ｎ 退 火温度 随扩增 的基 因不 ｉ， ｉ， 同而 异 ，ｍＡ 基 因 为 ５ ｃｌ ４℃ ，ｏ ｌ ｆ Ｒ基 因 为 ５ ，２ｃ ２ｃ ７ 二 ｃ 【 延伸 １ ｉ， ３ ｎ 共 ０个循环 ；２℃延伸 ５ｒ ｎ Ｃ ａ ｒ ７ ｉ。Ｐ Ｒ扩 ａ 增产物用 １ ％琼脂糖凝胶 电泳进行分析 ，ｏ ｎ Ｒ基 因 目
收 稿 日期 ：０ １ ０ — ６ ２ １ － ５ ０ 基金项 目： 中央高校基本科研 业务 费专项资金（ Ｌ ９ Ａ ０ ） Ｄ ０ Ａ ０ ５ 资助
６ ８ｂ ９ ｐ
注： Ｍ为ＤＬ ０ ５００Ｍａｋｒｌ４ ｒｅ，￣ 为部 分检测菌株 扩增结果 ，为 阴性 对照。 ５
图 １ ｃ Ａ基 因 Ｐ Ｒ 扩增 结 果 ｍｌ Ｃ