收稿日期:2005-11-17 修回日期:2005-12-22作者简介:李大明,男,1982年出生,在读硕士,从事植物蛋白酶解及天然级热反应肉味香精的研究。
大豆蛋白酶解的研究李大明,宋焕禄,祖道海北京工商大学化学与环境工程学院 (北京 100037)摘 要:用几种常用蛋白酶对大豆蛋白进行酶解,利用均匀设计安排试验,确定各种酶的最佳酶解条件,并以水解度(DH )为考察标准,选出水解度最大的酶,确定其最佳加酶量和酶解时间。
关键词:大豆蛋白;水解植物蛋白(HVP );水解度(DH );酶解;均匀设计中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文章编号:1672-5026(2006)02-0020-04Study on enzymatic hydrolysis of soybean proteinLi Daming ,Song Huanlu ,Zu DaohaiCollege of Chem ical and Envi ronmental Engi neeri ng ,Beiji ng Technology and B usi ness U niversity (Beiji ng 100037)Abstract :The enzymatic hydrolysis of soybean protein by several normal enzymes is studied.The best condition for enzymatic hydrolysis by experiments uniform designed is confirmed.Making hydrol 2ysis degree (DH )as the standard ,the best adding amounts and hydrolysis time of enzymes whose DH are largest are got.K ey w ords :soybean protein ;hydrolyzed vegetable protein (HVP );hydrolysis degree (DH );en 2zymatic hydrolysis ;uniform designs 大豆蛋白的营养价值很高,含有丰富的优质蛋白质,可以提供充足的人体所需的八种必需的氨基酸以及多种维生素和矿物质等[1]。
水解植物蛋白(HVP )是一种营养型食品添加剂,以其柔和丰满的鲜美口感广泛用于肉产品加工、方便面、膨化食品以及调味品中[2]。
特别是在Maillard 反应制备肉味香精的研究中,HVP 作为一种前体物质和丰富的氨基酸源得到广泛的应用。
Cadwallader 等人以酶解大豆蛋白为前体物质通过Maillard 反应制备肉味香精,并通过GC -MS 和GCO 检测分析出大量特征香味物质[3]。
因此HVP 在绿色食品添加剂的生产中将得到广泛的应用。
目前工业上主要采用酸水解法生产HVP 。
但酸水解反应条件激烈,会破坏氨基酸,此外,酸水解法会产生1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP )和3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD )具有致癌性[4]。
酶法水解具有条件温和、副反应少、水解程度容易控制,特别是在营养成分的保留上,具有不可比拟的优点。
随着酶工业的发展,酶解方法将替代酸法,成为水解大豆蛋白最有效的方法之一。
1 材料与方法111 材料11111 试验原料与主要试剂。
豆粕,购于北京和田宽酿造厂;甲醛溶液,优级纯,北京市旭东化工厂;L -酪氨酸,BR ,上海政翔化学试剂研究所;福林酚试剂,Sigma F -9252,北京欣经科生物技术有限公司;干酪素,BR ,北京双旋微生物培养基制品厂;复合风味酶(Flavozyme )、复合内切酶(Protamex )和碱性内切酶(Alcalase ),Novo Nodisk 公司;其他化学试剂均为分析纯;试验用水为蒸馏水。
2Vol.13,2006,No.2 粮食与食品工业Cereal and Food Indust ry食品科技11112 主要仪器设备。
精密数字酸度计,PHS -25C ,上海鹏顺科学仪器有限公司;可见分光光度计,Spectrumlab 22PC ,上海棱光技术有限公司;数显电子恒温水浴锅,HH -1,金坛市至翔科教仪器厂;光学读数分析天平,TG 328B ,上海第二天平仪器厂;上皿电子天平,JA2003,上海天平仪器厂;磁力加热搅拌器,H J -1型,江苏省国华仪器厂;微量凯氏定氮蒸馏装置,实验室自装。
112 试验方法11211 样品蛋白质含量的测定。
微量凯氏定氮法[5]11212 氨态氮测定。
甲醛电位滴定法[5]11213 酶活测定。
福林酚法[6]11214 水解度(DH )的计算。
D H =(N 2-N 1)/(N 0-N 1)N 2—酶解后游离氨基氮含量(%);N 1—酶解前游离氨基氮含量(%);N 0—总氮含量(%)。
11215 原料的预处理。
将豆粕粉用水充分浸泡后,于沸水浴中加热30min 进行熟化处理,用于酶解试验。
2 试验结果与讨论211 样品蛋白质含量的测定经凯氏定氮法测定,样品中的蛋白质含量为41123%。
212 酶活的测定表1为几种蛋白酶的特性参数,作为试验参考。
表1 几种蛋白酶的特性[7]酶的种类作用特性最适p H最适温度/℃复合风味酶内+外肽酶510～710≈50复合内切酶复合内肽酶515～71555～60碱性内切酶内肽酶615～81555～7521211 酪氨酸标准曲线的绘制。
图1 酪氨酸标准曲线线性方程:y =0101x +010155 相关系数:R 2=01999 吸光常数K =9814521212 酶活的测定。
表2 几种蛋白酶的酶活复合风味酶复合内切酶碱性内切酶测定温度/℃505555测定p H 值710615715称酶量01202g 01204g 1mL 稀释倍数1001001000吸光度A 1015500193301982吸光度A 2015570193601985吸光度A 3015550193501983平均吸光度A 015540193501983酶活力/U ·g -1107511796738573213 最佳酶解条件的确定以参考资料为依据,每组试验称取20g 豆粕,经过熟化处理后,在固液比1∶7的条件下[8],改变温度、时间、p H 、加酶量以及酶比等因素,运用均匀设计[9]来安排实验,进行酶解,达到反应时间后取出一定量的酶解液,用甲醛滴定法测定其水解度,然后用DPS 数据处理系统来分析其酶解的最佳条件,最后再用验证实验加以验证。
21311 复合风味酶(F )最佳酶解条件的确定。
表3 复合风味酶(F )酶解条件均匀设计表温度/℃时间/hp H 加酶量/%DH/%165551051710525526156211793607610115122445671042016857047153111636503515217165 DPS 处理结果为温度:50℃;时间:7h ;p H =618;加酶量:6%;DH =23175%。
验证实验结果:DH =23103%结果符合。
21312 复合内切酶(P )最佳酶解条件的确定。
表4 复合内切酶(P )酶解条件均匀设计表温度/℃时间/hp H 加酶量/%DH/%1605510510178250261561512035576101111154406710412175565471538136645351521117912粮食与食品工业 Cerealand Food Indust ry Vol.13,2006,No.2 DPS处理结果为温度:57℃;时间:7h;p H= 613;加酶量:6%;DH=17142%。
验证实验结果:DH=16168%结果符合。
21313 碱性内切酶(A)最佳酶解条件的确定。
表5 碱性内切酶(A)酶解条件均匀设计表温度/℃时间/h p H加酶量/%DH/%1755515510171 2652710612146 3707615111125 4556715410165 580481037165660361029146 DPS处理结果为温度:55℃;时间:7h;p H= 714;加酶量:6%;DH=12181%。
验证实验结果:DH=12156%结果符合。
21314 F+P组合酶最佳酶解条件的确定。
表6 F+P酶解条件均匀设计表温度/℃时间/h p H F∶P加酶量/%DH/%15576103526110 2506615115323175 35035152218155 46045100133420154 5552710015617187 66057151114175 DPS处理结果为温度:51℃;时间:7h;p H= 619;F∶P=3∶1;加酶量:6%DH=31187%。
验证实验结果:DH=30198%结果符合。
21315 F+A组合酶最佳酶解条件的确定。
表7 F+A酶解条件均匀设计表温度/℃时间/h p H F∶A加酶量/%DH/%15576153523112 2506710115319175 35036102214168 46045150133415187 5552715015615136 66058101111165 DPS处理结果为温度:50℃;时间:7h;p H= 713;F∶A=3∶1;加酶量:6%DH=28148%。
验证实验结果:DH=28115%结果符合。
由以上实验结果可以看出,在相同的加酶量和酶解时间条件下,F+P组合酶所得的水解度最高,因此下面将进一步确定F+P组合酶的最适酶解时间和加酶量。
214 F+P组合酶的最适酶解时间和加酶量的确定根据酶解均匀试验中所确定的最佳酶解条件,保持温度、p H以及酶比不变,改变酶解时间和加酶量进行酶解试验,测定不同加酶量和酶解时间下的水解度,作出酶解时间、加酶量和水解度的关系图(见图2),确定最适的酶解时间和加酶量。
图2 F+P组合酶酶解时间、加酶量和水解度的关系图由图可见,随着加酶量和反应时间的增大,水解度(DH)呈增大趋势,以水解度的大小为参考依据,兼顾经济因素可得F+P的最适加酶量为4%,酶解时间为8h。
3 结论①以外肽酶和内肽酶组合对大豆蛋白的水解效果比用单一的内肽酶对大豆蛋白的水解效果好,可以得到更高的水解度。
而且酶解大豆蛋白往往会产生苦味,这是由于内肽酶作用于蛋白质分子内部肽键,生成小分子肽段而产生苦味,而通过外肽酶和内肽酶协和作用可以大大降低酶解液的苦味[10]。
②以水解度为依据兼顾经济因素,F+P组合酶酶解大豆蛋白的最佳条件为:温度:51℃;p H= 619;F∶P=3∶1;加酶量为4%;酶解时间为8h。