2017.No.7 ---------------------------------------------------------CEREAL & FEED INDUSTRY
doi：10. 7633/j. issn. 1003-6202. 2017. 07. Oil
风味蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解大豆分离 蛋白制备多肋的研究
马诗文，高云，吴金龙，郝晓亮(辽宁科技大学化学工程学院，辽宁鞍山1M051)
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摘要：为了改善大豆蛋白的功能性质，使其在食品工业中有更广泛的应用，用酶来水解大豆蛋白，可以提高大豆 多肽的产率。本研究以大豆分离蛋白作为底物，配制不同浓度的大豆分离蛋白溶液，经预处理后，用风味蛋白酶、 中性蛋白酶进行酶解，得出两种酶的酶解最佳条件，即大豆分离蛋白溶液质量分数为4%、风味蛋白酶和中性蛋白 酶比例为3 : l，pH值为7. 5、酶解温度为45°C、酶解时间为7 h。在此条件下，溶液的水解度最高，经测定多肽含 量为 5. 162%。关键词：大豆分离蛋白；水解度；酶；多肽中图分类号：TS201. 2+l;TS 201. 2+5 文献标志码：A 文章编号：1003 —6202(2017)07 —0043 —03 Preparation of polypeptide by cohydrolysis of soybean protein isolated with flavor protease and neutral proteaseMA Shi-wen,GAO Yun,WU Jin-long,HAO Xiao-liang(College of Chemical Engineering, University of Science and Technology LiaoNing, Anshan 114051, China )ABSTRACT ： In order to improve the functional properties of soybean protein and make it have more extensive application in food
industry, the enzyme was used to hydrolyse soybean protein, which could improve the yield of soybean peptides. Using soybean protein isolated as the substrates, different concentrations solutions of soybean protein isolated were prepared, after pre- treatment, flavor protease and neutral protease were digested with the solution, the optimum condition were acquired as：the s〇- lution concentration of soybean protein isolated was 4% , the ratio of flavor protease and neutral protease was 3 : 1, the pH value was 7. 5, the enzymolysis temperature was 45°C , the enzymolysis time was 7 h. Under this condition, the degree of hydrolysis of the solution was the highest, the polypeptide content was 5. 162% by the experiment.KEYWORDS：soybean protein isolated； degree of hydrolysis； enzyme； polypeptide
大豆蛋白是国际上公认的较理想的植物蛋白 质。多肽克服了大豆蛋白在营养学上的弱点，具有 比大豆蛋白更丰富的营养和功能特性。大豆多肽已 经成为有效的辅助制剂，在发酵工业中，大豆多肽可 以作为微生物的营养源，促进微生物生长和代谢;在 食品工业中，大豆多肽可以应用于焙烤食品、糖果糕 点和冷饮食品中，既降低了成本，也改善了产品的风 味、口感和组织状态等。目前制备大豆多肽的方法 主要有微生物发酵法和酶解法，酶解法有单酶水解 法、双酶水解法以及复合酶酶解等方法。随着研究 的深入，人们逐渐认识到单酶水解法的不足，多酶复
合水解法渐渐成为了研究的重点，且制得的产品性 能普遍高于单酶水解法[14]。本实验采用大豆分离蛋白为原料，配成大豆分 离蛋白溶液，用酶水解生成大豆多肽。风味蛋白酶 和中性蛋白酶均为水解大豆蛋白的常见酶，多数研 究只针对于两种酶的单独水解，对于这两种酶的复 配水解，相关的报道并不多。本研究将风味蛋白酶 和中性蛋白酶进行复配，同时通过两种酶的复配来 比较酶的复配和单一酶对大豆分离蛋白作用的差 异，寻求两种酶的最佳配比。通过正交实验设计，综 合比较选出大豆多肽最佳生产工艺条件。
收稿日期：2017-02-04;修回日期：2017-06-23基金项目：辽宁省大学生创新创业训练计划项目（201410146000035);辽宁省普通高等学校本科教育教学改革研究项目（UPRP20140453;2016 一 145);辽宁省高等教育研究“十三五”规划课题（课题编号：GHYB160159); 2016年辽宁科技大学大学生创新创业训练计划项目 (DC2016124)。作者简介：马诗文（1995-)，女，本科，专业方向为食品生物技术。通讯作者:郝晓亮（1980-)，男，讲师，博士，研究方向为生物制药及食品生物技术。44马诗文等：风味蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解大豆分离蛋白制备多肽的研究/2017圧* 7期
1材料与方法1.1材料与试剂大豆分离蛋白（哈高科大豆有限责任公司，蛋白 质质量分数为85. 39%);风味蛋白酶及中性蛋白酶 (天津市诺奥科技发展有限公司，酶活分别为1. 839 Ug/ml，2. 352 Ug/ml);其他试剂均为分 析纯。1.2仪器与设备DDY-2A凯式定氮仪，JA2003A电子天平， PHSJ-3F实验室pH计，DHZ-9240型电热恒温鼓 风干燥箱，S212恒速搅拌器，722S可见分光光度 计,HH-8数显恒温水浴锅。1.3 大豆分离蛋白酶解工艺[5-9]大豆分离蛋白—85°C保温15 min—冷却到酶 适宜的温度—调节pH值—放人水浴锅中，调节温 度—加人水解所需的酶—水解适当的时间—取出酶 解液迅速升温到90°C并保持20 min灭酶—冷却— 4 000 r/min离心15 min—提取上清液-►装瓶冷藏 备用。1.4水解度的测定采用甲醛滴定法测定蛋白质的水解度[1°11]。 取大豆分离蛋白水解液2 ml于锥形瓶中，分别加人 20 ml水，加入甲基红指示剂3滴，用0. 05 mol/L NaOH滴至橙黄色，加人40%中性甲醛溶液5 ml, 加入酚酞指示剂3滴，再用0. 05 mol/L NaOH滴 至橙黄色，并记下用量将大豆分离蛋白用6 mol/L HC1,100°C水解 2 h，使蛋白质彻底水解。用上述方法测定，记下用 去的 0. 05 mol/L NaOH 的用量 V2。
水解度=gxioo %。1.5 多肽含量的测定方法[12]在酶解液中加入酸,调至蛋白质的等电点，经离 心后，沉淀下来的是蛋白质，而多肽及少量的氨基酸 仍留在溶液中，由Folin-酚法测出上清液中的多肽 含量。
2结果与分析2.1 单因素对酶解反应的影响 2.1.1风味蛋白酶和中性蛋白酶的比例对酶解反 应的影响通过预实验得知，在风味蛋白酶和中性蛋白酶 进行复配时，风味蛋白酶起主要作用，因此，在做进一步实验时加入了更多的风味蛋白酶以提高酶解效 果。在前期研究中，笔者重点考察了底物质量分数 对大豆分离蛋白酶解的影响，最终认为4%的底物 质量分数对于水解是比较有利的，这与其他文献报 道的底物质量分数是一致的[13_14]。在底物质量分 数为4%、温度为45°C、时间为7 h、pH值为7.0时， 取风味蛋白酶和中性蛋白酶比例为1 : 1、2 : 1、 3 : 1、4 : 1、5 : 1来考查复合酶配比对水解度的影 响。由表1数据可知，当风味蛋白酶和中性蛋白酶 的比例选取3 : 1时，能取得较好的酶解效果。表1不同复合酶配比酶解的水解度值复合酶配比水解度/%1:146.312:151.213:156.124:152.235:148.202.1.2 pH值对酶解反应的影响在底物质量分数为4%、温度为45°C、时间为 7 h的条件下，pH值调节为6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0 的情况下进行水解，完成后测定水解度见表2:表2不同pH值酶解的水解度值时间/h风味酶水解度/%中性酶水解度/%6.046.5448. 216. 547.4250.147.050.1352. 367. 542.6546. 278.040.1342. 22由表2数据可以看出，水解度的值会随着pH 值的变化而不同，当处于碱性的时候，水解度会下 降。两种酶在pH值为7.0的时候，水解度较高，说 明水解效果好。可能是因为风味酶和中性酶等电点 均在7.0左右，当pH值偏离了其等电点，在碱性条 件下，溶液中多余的氢氧根离子可能会抑制水解反 应的发生，影响酶对蛋白质的水解效果。2.1.3温度对酶解反应的影响用风味蛋白酶、中性蛋白酶对大豆分离蛋白进 行水解，在底物质量分数为4%、时间为7 h、pH值 为7.0的条件下，调节酶解温度为40、45、50、55、 60 °C，测定水解度。由表3可以看出，水解度的值会随着温度的变 化有不同，过低的温度使酶和蛋白质的结合位点没 有被激活，不利于水解；过高的温度会使酶变性，变 性后的酶活性丧失，无法使蛋白质水解。根据实验