浮游动物研究新技术和方法摘要浮游动物是海洋生态系统中非常重要的类群，是海洋生物生产过程的核心之一，是海洋食物网的基础和关键组成部分，对其种类的定性识别、鉴定和生物量分析是海洋科学研究中最为关键的科学问题之一。

从早期的Utermöhl法、数字图像处理技术，到现在的化学计量学研究、图像观测技术等创新方法，都极大地促进了海洋浮游动物的研究。

本文重点讲述几种传统技术与创新技术的定义、应用以及对比分析，以更好地分析浮游动物研究方法房展需求和方向。

关键词：浮游动物；研究方法；对比分析一、概况浮游动物是一类经常在水中浮游，本身不能制造有机物的异养型无脊椎动物和脊索动物幼体的总称，在水中营浮游性生活的动物类群。

它是经济水产动物，是中上层水域中鱼类和其他经济动物的重要饵料，对渔业的发展具有重要意义。

国际上许多重大研究计划，如全球海洋生物普查计划（Census of Marine Life，CoML）、海洋生物地球化学与生态系统整合研究（Integrated Marine Biogeochemistry and Ecosystem Research，IMBER）和全球海洋生态系统动力学研究（Global Ocean Ecosystem Dynamics，GLOBEC）等，均将浮游动物作为重要观测内容[1]。

浮游动物观测的最终目的是对目标生物的分布、丰度、大小或生物量进行准确估计。

二、传统的研究技术方法（一）Utermöhl方法浮游生物定量生物学的研究最早是从德国Kiel大学的生物学家Victor Hensen开始的，他于1883年利用鱼卵网(Hensen′s Eiernetz)对浮游生物进行了调查研究，这是一款从Johannes Mǜller的蝴蝶型网改进而来的网具。

Hensen在其论文[2]中首次定义了“浮游生物”一词，并提出使用网采手段加上严格的数学计算作为浮游生物定量生物学研究的方法。

Utermöhl于1931年发明了一种计数框计数方法[3]，它结合了V olk的静置沉淀法和Kolkwitz计数框，最低程度地降低了样品的损失。

直到Utermöhl在1958年对计数框观测面积进行了的标准化，Utermöhl方法才被确认和推广开来。

Utermöhl方法的一般分析过程为:对采来的水样摇匀后注入Utermöhl计数框中→在沉降柱上盖好沉降柱盖玻片→静置沉降24 h以上→将上清液移除入废液框中→盖好底座盖玻片→于倒置显微镜或光学显微镜上进行鉴定和计数。

Utermöhl方法应用的主要工具是计数框，Utermöhl计数框有100,50,25,10,5 mL5种类型，其中最重要的部件是载玻片和沉降柱。

沉降柱和透明塑料板之间要求没有缝隙，同时又要确保整个计数框的体积十分精确。

载玻片要越薄越好，所以一般用直径26mm或更大的薄玻片进行加工。

另一种常用的方法就是就是使用变型的Utermöhl计数框进行计数，此方法的有点是把去除上清液的步骤省去了，使准备样品工作更加简单，但受到倒置显微镜载物台高度的限制，最多只能检测25 mL的样品[4]。

（二）数字图像处理技术数字图像处理技术是以平移、旋转和尺度变换不变特性的数学形态学特征和Gabor纹理特征共同组成特征集，采用支持向量机(SVM)和主成分分析特征降维相结合的浮游生物图像在线分析方法。

1.图像处理与特征提取首先对采集的原始图像进行预处理，采用7×7邻域的中值滤波器方法去除大部分的图像噪声[5]，然后采用`UnSharp'算子增强目标与背景之间的对比度，同时去除由于浮游动物运动所产生的拖影，以增强图像的结构特征。

图像经预处理之后，采用Canny算子检测轮廓边缘。

Canny算子有两个重要参数`thresh-old'和`sigma'[6]，当这两个参数指定到恰当的数值，即可得到连续的目标轮廓边缘。

目标及其边界确定之后，即可从轮廓特征和目标区域中计算出特征描绘子。

2.支持向量机(SVM)支持向量机的基本思想是在特征空间或样本空间，构造出最优超平面，达到与不同类样本集之间的最大距离，从而达到最大的泛化能力[7]。

支持向量机结构相对简单，并且具有全局最优性和较好的泛化能力，能有效解决函数估计和模式识别问题。

在许多应用领域中都表现出它优于已有方法的性能[8]。

SVM方法在小样本情况下能够最大限度地提高预报可靠性，即从有限的训练集样本中得到的小的误差，对独立的测试集保持小的误差仍能够保证，另外在解决高维模式识别及非线性问题中也表现出许多特有的优势。

三、创新研究技术及方法（一）化学计量学研究生态化学计量学可以简单定义为: 从分子到生物圈的元素生物学。

它是根据三大守恒定律( 质量守恒、能量守恒和电荷守恒定律) 、分子生物学中心理论和自然选择法则[9]，结合生物学、物理学、生态学和化学计量学的基本原理，研究生物系统能量的平衡和多种化学元素( 通常是C、N、P、O、S)平衡的科学。

其跨越了环境以及分子、个体、种群、群落和生态系统等各个层次，是构建从分子到生态系统统一化理论的新思路[10]。

随着科学理论和技术的发展，更加细化的化学计量学研究是生态科学发展的必然趋势。

生化物质是限制元素对浮游动物影响的主要媒介，特定的生化物质在生物体内具有特定功能，研究元素化学计量与生化物质之间的关系对于提高人们对物种生活历史和不同物种间的相互作用认识有着重要意义[11]。

元素比率的不同会反映出生物体个体发育过程中大分子的组成及其化学计量的变化，如幼体一般比成体具有更高的生长率，反映在幼体的化学计量上具有更高的P 含量和更低的N：P 值。

不同身体部位和组织的元素组成也有差异，如生殖腺含有更多的P。

不同生活史阶段和季节，其化学计量也会有变化，如高纬度的海洋桡足类，其快速生长的幼体和储存脂肪的成体(夏季和秋季)最适宜食物的计量特征有很大差异[12]。

不同生境的生物，其化学计量也会有不同。

Ventura研究发现，淡水和海洋浮游动物的主要生化物质种类保持稳定，其元素组成的差异主要来自于生化物质的不同比例，认为淡水物种N库中蛋白质含量最高，其次为核酸；而海洋物种N库中蛋白质最高，其次为氨基酸。

淡水物种P库中核酸含量最高，而海水物种P库中磷脂含量最高。

海洋生态化学计量学对海洋生物体在不同情形下的元素含量已经有了一定程度的研究，但缺乏更深入的对元素吸收及利用的机理研究（二）图像观测技术浮游生物成像系统能够在水平和垂直的精细尺度上产生浮游生物的分布数据，相比于传统浮游生物样品处理过程能够节约大量时间。

为此，许多研究组织正在开发有效的方法，从浮游生物图像中提取有用信息。

浮游生物成像系统根据不同的应用目的可分为两大类，即实验室成像系统和野外原位成像系统。

对于已经采集并使用固定剂保存的浮游生物样品，可以在实验室直接进行成像和数字化。

这种方法逐渐成为一种普遍的样品保存方式。

浮游生物扫描仪(ZooScan)的出现是浮游生物图像领域一个重要的发展，能为已经保存的浮游生物样品创造高精度的数字记录[13]。

结合扫描传感器、光学系统和防水扫描室，可以将浮游动物样品置入其中，在高分辨率下数字化，并且毫无损伤地回收样品。

所产生的图像能够通过专门的软件进行识别、计数和测定。

这种方法已在一些海域得到很好应用，如地中海、加利福尼亚沿海等[14]，并取得了一系列的研究成果。

ZooScan技术有效地推动了浮游动物样品的分析效率，为大尺度、长时间序列的浮游生物生态学和功能类群的研究提供了一种快速、标准化的手段。

在野外原位成像系统的研究中，目前应用较好的有水下视频剖面仪(Underwater Video Profiler，UVP)，浮游生物视频记录器二代(Video Plankton RecorderⅡ，VPR Ⅱ)等[15]。

二者的工作方式不同，UVP多用于浮游动物垂直剖面的定量观测，最新型号的UVP5可以与温盐深探测仪CTD(Salinity Temperature Depth)整合，也可与浮标结合，实时获取图像与环境信息。

VPR主要用于水平拖曳，记录0.2~20.0mm粒级浮游生物的水平分布格局。

在此基础上，小型和微型浮游生物的原位观测研究也取得进展，如流式影像术(Flow-CAM)主要用来进行微型浮游动物和浮游植物的成像与自动分析，工作粒径范围降低到5~1000μm[1]。

四、讨论相对于浮游动物研究传统方法，化学计量学研究、图像观测技术等新技术具有精确度高、辨识率强、方便快捷等优势，但受到仪器仪表、技术领域的限制，应用物种及范围仍受到限制。

例如对于许多物种，2D图像难以满足分类学上的需求，必须有高精度可旋转的3D 图像或者标本的线断层扫描图像才能达到原位实时观测的目的。

要解决与生物多样性有关的科学问题，需要针对大的水体进行物种丰度和形态变化的分析。

对于这些研究，需要有物种分类学的详细信息，因此需要有高精度的图像来支持。

随着生物科技的进一步发展，对浮游动物快速分类、计数和生物量估算成为可能，对于海洋浮游生物功能群的研究、生物生产过程以及生态模拟研究将提供有力的技术支撑。

五、参考文献[1] 孙晓霞, 孙松. 海洋浮游生物图像观测技术及其应用［J］. 地球科学进展, 2014,29(6):74 8-755.[2] Hensen V.ǜber die Bestimmung desPlanktonsoder des imMeere treibendenMaterials an Pflanzen und Thieren.Kommission zurwissenschaftlichen Untersuchung der deutschen Meere in Kiel,1882-1886[R].V Bericht Jahrgang 12-16,1887:1-107.[3] Utermöhl H.Neue Wege in der quantitativen Erfassung desPlankton(mitbesonderer Berǜcksichtigung desUltraplankton)[J].Mitt int Ver theor angewLimnol,1931,5(2):567-596.[4] 孙军,刘东艳,钱树本. 一种海洋浮游植物定量研究分析方法---Utermöhl方法的介绍及其改进[J].黄渤海海洋,2002(6):105-112.[5] Canny J putational approach to edge detection[J].IEEE Transactions on Pattern Analysis and Ma-chine Intelligence,1986,8:679-698.[6] Jaffries H P,Berman M S,Poularikas A D,et al. Automated sizing and counting and identification ofzooplankton by pattern recognition[J].Marine Biolo-gy,1984,78:329-334.[7] 张学工.关于统计学习理论与支持向量机[J].自动化学报,2000,26(1):32-42.[8] Cherkassky V,Mulier F.Learning from data:con-cepts,theory and methods[M].New York:John Vi-ley&Sons,1997.[9] Hong J-T(洪江涛),Wu J-B(吴建波),Wang X-D(王小丹),Effects of global climate change on the C,N and P stoichiometry of terrestrial plants. Chinese Journal of Applied Ecology(应用生态学报), 2013,24(9):2658-2665(in Chinese).[10] He J-S(贺金生), Han X-G(韩兴国). Ecological stoichiometry: Searching for unifying principles from individuals to ecosystems. Chinese Journal of Plant Ecology(植物生态学报),2010,34(1):2-6(in Chinese).[11] 陈蕾,李超伦海洋浮游生物的生态化学计量学研究进展[J].应用生态学报,2014,25(10):3047-3055.[12] Aubert A, Svensen C, Hessen D, et al. CNP stoichiometry of a lipid-synthesizing zoo -plankton, Calanus finmarchicus, from winter to spring bloom in a sun-Arctic sound. Journ -al of Marine Systems, 2013, 111/112:19-28.[13] Benfield M C, Grosjean P, Culverhouse P F, et al. RAPID research on automatrd pla -nkton identification[J]. Oceanoaraphy, 2007,20(2):172-187.[14] Gorsky G, Ohman M D, Picheral M, et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system[J]. Journal of Plankton Research, 2010,32(3):285-303. [15] 任琳琳. 流式影像术在黄东海浮游植物群落结构研究中的应用[D]. 北京:中国科学院大学,2013.。