血清4型禽腺病毒病诊断技术Diagnostic techniques for the disease of serotype4fowl adenovirus目次前言 (V)引言 (V)1范围 (1)2规范性引用文件 (1)3缩略语 (1)4临床诊断 (1)4.1流行病学 (1)4.2临床症状 (2)4.3剖检病变 (2)4.4临床诊断 (2)5PCR诊断 (2)5.1器材 (2)5.2试剂 (2)5.3操作方法 (3)5.4结果判定 (3)6病毒分离 (3)6.1器材 (3)6.2细胞 (4)6.3试剂 (4)6.4操作方法 (4)6.5结果判定 (4)7间接免疫荧光鉴定 (5)7.1器材 (5)7.2细胞 (5)7.3试剂 (5)7.4操作方法 (5)7.5结果判定 (6)8血清抗体检测 (6)8.1器材 (6)8.2试剂 (6)8.3操作方法 (6)8.4结果判定 (7)9综合判定 (7)附录A（规范性）溶液配制 (8)A.1磷酸盐缓冲液的配制 (8)A.2组织研磨液的配制 (8)A.3细胞培养液的配制 (8)A.4细胞维持液的配制 (8)A.5细胞固定液的配制 (8)A.650×TAE缓冲液的配制 (8)A.71%琼脂糖凝胶的配制 (9)附录B（资料性）血清4型禽腺病毒感染鸡群临床解剖症状 (10)B.1FAdV-4感染鸡群典型临床解剖症状判定标准图例 (10)附录C（资料性）阳性对照病毒 (11)C.1阳性对照病毒来源 (11)附录D（资料性）PCR检测引物及判定标准 (12)D.1血清4型禽腺病毒PCR检测引物 (12)D.2引物的稀释 (12)D.3PCR检测判定标准图例 (12)D.4PCR扩增片段参考序列 (13)附录E（资料性）间接免疫荧光鉴定用单克隆抗体及判定标准 (14)E.1单克隆抗体的来源 (14)E.2间接免疫荧光鉴定判定标准图例 (14)附录F（规范性）血清4型禽腺病毒抗体检测ELISA试剂盒使用溶液的配制 (15)F.1包被缓冲液 (15)F.2封闭液 (15)F.3样品稀释及洗涤液 (15)F.4终止液 (15)附录G（规范性）血清4型禽腺病毒抗体检测ELISA试剂盒抗原包被板及阴性、阳性对照血清的制备 (16)G.1血清4型禽腺病毒抗体检测试剂盒抗原包被板的制备 (16)G.2阴性对照血清的制备 (16)G.3阳性对照血清的制备 (16)血清4型禽腺病毒病诊断技术1范围本标准规定了血清4型禽腺病毒病诊断技术的要求。
本标准规定的临床症状和病理变化适用于血清4型禽腺病毒病的初步诊断；聚合酶链式反应（PCR）检测方法适用血清4型禽腺病毒的核酸鉴定；病毒分离技术适用于血清4型禽腺病毒的分离培养；间接免疫荧光（IFA）检测方法适用于血清4型禽腺病毒的病原鉴定；间接ELISA抗体检测方法适用于血清4型禽腺病毒自然感染鸡群血清学诊断及免疫鸡群抗体水平监测。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。
NY/T541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范。
3缩略语下列缩略语适用于本文件。
FAdV-4血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype4）PCR聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）PBS磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline）PBST吐温磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline with Tween）DNA脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）LMH细胞鸡肝癌细胞（Leghorn male hepatocellular cells）ELISA酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay）TMB四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine）TCID50半数细胞感染量（Median tissue culture infective dose）CPE细胞病变效应（Cytopathic effect）4临床诊断4.1流行病学感染一般发生于3~6周龄肉鸡及10~20周龄蛋鸡，但各种日龄鸡只均可感染FAdV-4。
FAdV-4强毒自然感染潜伏期为1~2天，感染后3~5天出现死亡率高峰；死亡率一般为20%~80%，有时甚至达到100%。
4.2临床症状突发高死亡率，家禽临床症状表现：精神沉郁、食欲不振、嗜睡、拉黄绿色稀粪、黄疸。
4.3剖检病变心包积液：心包囊出现无色或黄绿色积液。
肝炎：肝脏肿大、质脆、边缘钝圆、出血，有大理石状花斑，并有明显坏死灶。
肾炎：肾脏肿胀、有些出血点。
4.4临床诊断当禽出现4.2及4.3（判定标准图例参见附录B.1）部分或全部情形时，可判定为FAdV-4感染疑似病例。
确诊需要实验室诊断。
5PCR诊断5.1器材5.1.1PCR扩增仪5.1.2组织研磨仪5.1.3台式低温高速离心机5.1.4核酸电泳仪5.1.5核酸电泳槽5.1.6电泳凝胶成像仪5.1.7冰箱：4℃、-20℃、-80℃5.1.80.2~2μL、2~20μL、20~200μL和200~1000μL移液器5.2试剂5.2.1商品化DNA提取试剂盒5.2.2商品化PCR试剂盒5.2.3商品化核酸染料及DNA Marker5.2.4引物FAdV-4F和FAdV-4R（附录D.1）5.2.5灭菌去离子水5.2.6PBS缓冲液（附录A.1）5.2.7组织研磨液（附录A.2）5.2.81×TAE缓冲液（附录A.6）5.2.91%琼脂糖凝胶（附录A.7）5.3操作方法5.3.1样品准备空白对照样品：高压处理过的去离子水。
阴性对照样品：其他禽源病毒基因组。
阳性对照样品：SD15毒株基因组（参见附录C），或其他背景清楚的FAdV-4毒株基因组。
待检样品：取待检样品1.0g，加入1mL组织研磨液充分研磨，制成混悬液后于37℃水浴锅反应30min；在4℃条件下以12000rpm离心20min后，取上清，以0.22μm滤器过滤，转移至1.5mL离心管，即为肝组织研磨上清液。
采用商品化的DNA提取试剂盒，按说明书完成核酸DNA提取。
5.3.2PCR反应按照商品化PCR试剂盒说明书要求，在反应体系加入各成分中，混匀。
反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，反应结束后置4℃冰箱保存备用。
5.3.3PCR产物凝胶电泳配置1.0%琼脂糖凝胶（含核酸染料），带加样孔的一端放置在电泳槽的阴极，倒入1xTAE缓冲液浸泡过胶面，依次点样（DNA Marker、阳性对照样品、阴性对照样品、空白对照样品、待检样品）中进行电泳，恒压120V，电泳约40min，在电泳凝胶成像仪中观察、拍照、记录结果。
5.4结果判定5.4.1试验成立的判定空白对照或阴性对照样品无扩增条带，阳性对照样品出现约280bp的条带，则试验成立（判定标准图例参见附录D.3）。
5.4.2试验结果的判定在试验成立的前提下，待检样品无条带（参见附录D.3），则判定待检样品为FAdV-4核酸阴性；在试验成立的前提下，待检样品出现约280bp的条带（参见附录D.3），则判定待检样品为FAdV-4核酸阳性；必要时，将目的条带进行胶回收后克隆测序，待测样品的测序结果和参考序列（参见附录D.4）进行核苷酸同源性比较，同源性在95.0%以上判为阳性。
6病毒分离6.1器材6.1.1倒置显微镜6.1.20.2~2μL、2~20μL、20~200μL和200~1000μL移液器6.1.3细胞培养箱6.1.4台式低温高速离心机6.1.56孔细胞培养板6.1.637℃恒温箱6.1.7冰箱：-80℃6.2细胞6.2.1LMH细胞6.3试剂6.3.10.25%胰酶6.3.2PBS缓冲液（附录A.1）6.3.3细胞培养液（附录A.3）6.3.4细胞维持液（附录A.4）6.4操作方法6.4.1细胞准备感染前一天将生长状态良好的LMH细胞以PBS洗涤一次，弃去PBS，以0.25%胰酶消化为单个细胞后加入适量的细胞培养液，以吸头吹散细胞，并按2mL/孔培养于6孔板，置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养过夜，待细胞长至70%时（12-16h）开始进行感染。
6.4.2样品准备待检样品：按5.3.1处理的PCR阳性肝组织混悬液上清，以细胞维持液稀释10、20倍待用。
阴性对照：细胞维持液。
6.4.3样品接种和培养弃细胞培养液，以PBS洗一遍。
取1mL6.4.2所述样品均匀铺满细胞，每个样品做2个重复孔，每块板子设置2个以上阴性对照孔，吸附2h后，以PBS洗一遍，弃去PBS，加入2mL细胞维持液。
培养3-5天后，观察细胞是否出现CPE。
6.5结果判定6.5.1试验成立的判定阴性对照样品保持正常细胞形态，则试验成立。
6.5.2试验结果的判定每日在倒置显微镜下观察细胞培养是否出现CPE。
如出现CPE，即LMH细胞形态变圆、皱缩、脱落等典型病变，可判定病毒分离成功；如未出现CPE，将细胞培养物冻融3次，离心取上清接种LMH进行盲传，直至出现CPE。
将出现CPE的细胞培养物于-80℃反复冻融3次，离心收集细胞培养物上清，即分离得到的病毒。
分离得到的病毒需进一步通过PCR诊断（5）或间接免疫荧光鉴定（7）是否为FAdV-4。
7间接免疫荧光鉴定7.1器材7.1.1荧光显微镜7.1.20.2~2μL、2~20μL、20~200μL和200~1000μL移液器7.1.3细胞培养箱7.1.496孔细胞培养板7.1.537℃恒温箱7.2细胞7.2.1LMH细胞7.3试剂7.3.10.25%胰酶7.3.2PBS缓冲液（附录A.1）7.3.3细胞维持液（附录A.4）7.3.4细胞固定液（附录A.5）7.3.5FAdV-4特异性单克隆抗体1D7（附录E.1）7.3.6商品化的FITC标记的羊抗鼠IgG7.4操作方法7.4.1样品准备待检样品：5.3.1中PCR阳性样品（肝组织研磨液上清）或6.5.2中细胞分离得到的病毒样品（细胞培养物上清）感染的LMH细胞。
样品的接种与培养，见6.4.3。
阴性对照样品：未感染的LMH细胞。
阳性对照样品：毒株SD15，或其他背景清楚的FAdV-4毒株感染的LMH细胞。
7.4.2间接免疫荧光试验7.4.2.1弃去细胞培养液，室温下以固定液固定细胞5min，每孔50μL。
7.4.2.2弃去固定液，室温下自然吹干2h，以PBS洗涤一次。