DB42/T—2020 4型禽腺病毒抗体ELISA检测规程
1范围
本文件规定了4型禽腺病毒抗体ELISA检测的术语和定义、实验原理、检测条件、检测方法、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施。

本文件适用于4型禽腺病毒鸡血清抗体的检测。

2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法。

3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。

4实验原理
本文件采用酶联免疫吸附法（ELISA），该方法利用抗原抗体反应具有特异性，将特异性的4型禽腺病毒五邻体蛋白（penton）吸附到固相载体的表面后，待测物中若含有相应的4型禽腺病毒抗体，则可与所包被的五邻体蛋白（penton）相结合，并能继续和相应的辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体结合形成复合物。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与待测物中4型禽腺病毒抗体的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

5检测条件
5.1试剂及耗材
5.1.1试剂
纯化的4型禽腺病毒五邻体蛋白（penton）、酶标记物（辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体）、底物液显色液、终止液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、包被液、封闭液。

试剂配方及4型禽腺病毒五邻体蛋白、阳性对照、阴性对照的制备见附录A。

5.1.2耗材
酶标板（96孔）。

5.2设备
1
DB42/T—2020
2酶标检测仪（配备450nm滤光片）、单道移液器（10μL）、8道移液器（300μL）、微量振荡器、恒
温箱（37℃）。

6检测方法
6.1抗原包被板的制备
6.1.1包被
将纯化的4型禽腺病毒五邻体蛋白（penton）用包被液稀释到0.625ng/μL，加入酶标板中，每孔加100μL，2℃～8℃包被12-15h。

6.1.2封闭
弃去包被液，每孔加入封闭液200μL，置37℃恒温箱中温育2h；弃去孔中液体，再置37℃恒温箱中干燥2h，密封2℃～8℃保存。

6.2洗涤液的配制
使用前，将20倍浓缩洗涤液恢复至室温22℃～25℃，并摇动使沉淀溶解，按照50mL20倍浓缩洗涤液加入950mL去离子水的比例稀释，稀释好的洗涤液在2℃～8℃保存，有效期为7日。

6.3待检血清的稀释
将5μL血清加入到95μL样品稀释液中，微量振荡器混匀，再取5μL混匀后的血清加入到120μL样品稀释液中，微量振荡器混匀备用。

6.4检测步骤
6.4.1待检样品温育
从冷藏环境中取出包被板，平衡至室温22℃～25℃后打开使用。

先用洗涤液洗涤抗原包被板1次，弃去孔中洗涤液，将稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照各取100μL，加至抗原包被板中，阴、阳性对照各设2孔，置37℃恒温箱中温育45min。

阴性对照血清和阳性对照血清无需稀释。

6.4.2洗涤
弃去孔中液体，每孔加入洗涤液300μL/孔，重复洗涤4次，最后一次拍干。

6.4.3酶标记物的温育
将辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体用封闭液作1:20000倍稀释，每孔加入100μL，置37℃恒温箱中温育45min。

6.4.4洗涤
重复步骤5.4.2。

6.4.5底物显色
每个反应孔加入底物显色液100μL，置22℃～28℃下避光显色15min。

DB42/T —2020
36.4.6终止
每孔加终止液50μL，10min内用酶标仪在波长450nm处测定各孔的OD值结果。

7
结果判定7.1试验成立条件
两个阳性对照孔的OD 450nm 值均＞1.0，且相差＜0.2；阴性对照孔OD 450nm 值均＜0.3时试验成立。

7.2结果计算Cut-off值按式（1）确定：
N P N S CO off Cut --=
-）值（ (1)
式中：
CO ——阴阳性判定临界值；
S ——样品测定孔OD 450nm 值；
P ——阳性对照孔平均OD 450nm 值；
N ——阴性对照孔平均OD 450nm 值。

7.3结果判定CO＞0.15判定为阳性；CO≤0.15判定为阴性。

8废弃物处理和防止污染的措施
实验过程中注意做好个人的安全防护工作，废弃物应做好无害化处理。