蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本 单位－氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的 一级结构是了解蛋白质功能的基础
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本章内容提要
第一节 全自动DNA测序仪
一、工作原理 （一）双脱氧链末端终止法测序原理
（二）新生链的荧光标记原理 （三）荧光标记DNA的检测原理
二、全自动DNA测序仪的结构与功能 （一）仪器的组成
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（二）新生链的荧光标记原理
• 荧光标记引物法
Primer Primer Primer Primer
A
G
C
T
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图18-8 荧光标记引物法原理 ► ◄ ■
（二）新生链的荧光标记原理
多色荧光标记法 -- 荧光标记终止底物法
定义：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷 酸上
反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记， 带有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终 止的同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料 经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来 判断所代表的不同碱基信息
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（二）新生链的荧光标记原理
• 荧光染料 标记法
单色荧光标记法
荧光标记引物法
荧光标记终止底物法 荧光标记引物法 荧光标记终止底物法
多色荧光标记法
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（二）新生链的荧光标记原理
多色荧光标记法 -- 荧光标记引物法
定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5’端
一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光 染料颜色不同 测序反应中，模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物 等按A、T、C、G编号被置于4支微量离心管中，A、T、 C、G四个测序反应分管进行，上样时合并在一个泳道内 电泳。特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸 底物保持对应关系
T TGACCGGA T
G C
T
T T G
T
C C A A C
G C
A T
G
G C
T
G
A
A
图18-4 双脱氧链末端终止法测序反应原理（2） ◈ ⊃
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（一）双脱氧链末端终止法测序原理
T
图18-5 双脱氧链末端终止法测序反应原理（3） ◈ ⊃
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（一）双脱氧链末端终止法测序原理
A
C
G
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图18-6 双脱氧链末端终止法测序反应原理（4） ◄ ■ ⊃ ►
(1)自动进样器区功能
①自动进样器受程序控制进行三维移动，因负极 电极和毛细管均固定不动，故许多操作如毛细管 进入样品盘标本孔中进样、电极和毛细管在电极 缓冲液瓶、洗涤液和废液管中移动等均依靠自动 进样器的移动完成；
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（二）仪器各组成部分的功能
②电极为电泳的负性电极，测序过程中，正、负 极之间的电势差可达15000伏，如此高的电势差 可促进DNA分子在毛细管中很快泳动，达到快速 分离不同长度DNA片段的目的；
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（一）双脱氧链末端终止法测序原理
利用DNA的体外合成过程－－聚合酶链反应 （polymerase chain reaction, PCR）
DNA聚合酶的催化 以目的DNA为模板 按照碱基互补配对原则 在引物的引导下
单核苷酸聚合形成新DNA链
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（一）双脱氧链末端终止法测序原理
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（二）新生链的荧光标记原理 单色荧光标记法
• 也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法 • 与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法 和荧光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个 反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物 也分别在不同泳道中电泳
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（二）新生链的荧光标记原理
• 普通的PCR反应体系中，加入 的核苷酸单体为 4种2’-脱氧核苷 三磷酸（dATP，dCTP，dGTP， dTTP）
图18-1 dNTP结构示意图 ◄ ■ ◈ ⊃ ►
（一）双脱氧链末端终止法测序原理
• 测序反应体系中，加入的核苷酸
单体为 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸
（ddNTP）
图18-2 ddNTP结构示意图 ◄ ■ ◈ ⊃ ►
（二）仪器各组成部分的功能
三、全自动DNA测序仪的常见故障及维护
（一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护 （二）平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护
四、全自动DNA测序仪的进展 五、全自动DNA测序仪的主要应用
第二节
蛋白质自动测序仪
一、蛋白质测序仪的工作原理 二、蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能 三、蛋白质测序仪的主要应用
③样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试 48或96个样本； ④电极固定螺母起固定电极及毛细管的作用。
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（二）仪器各组成部分的功能
(2)凝胶块区功能
①注射器驱动杆：给注射器提供正压力，将注射器 内的凝胶注入毛细管中。在分析每一个样品前，泵 自动冲掉上一次分析用过的胶，灌入新胶； ②样品盘按钮：控制自动进样器进出； ③注射器固定平台：起固定注射器的作用；
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（二）新生链的荧光标记原理
A G C T
模板：T C C A T G A T 产物：A G AG G AGG T AGGT A AGGTA C AGGTAC T AGGTACT A
◈ ⊃ 新生链的荧光标记原理 ► 图18-9 ■ ◄
（二）新生链的荧光标记原理
荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点：
本章小结
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第一节 全自动DNA测序仪
DNA测序
早期：小片段重叠法 通过测定RNA序列来推测DNA序列
核苷酸序列
缺点：既费时又不准确
20世纪80年代以后 ：DNA自动测序仪 Sanger双脱氧链末端终止法
Maxam-Gilber化学降解法
优点：操作简单、安全、快速、准确
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一、全自动DNA测序仪工作原理
④电极：为电泳的正性电极，始终浸泡在正极缓冲 液中；
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（二）仪器各组成部分的功能
⑤正极缓冲液阀：当注射器驱动杆下移，将注射 器内的凝胶压入毛细管时，缓冲液阀关闭，以防 止胶进入缓冲液；电泳时此阀打开，提供电流通 道； ⑥玻璃注射器：储存凝胶高分子聚合物以及在填 充毛细管时提供必要的压力； ⑦毛细管固定螺母：固定毛细管； ⑧废液阀：在清洗泵块时控制废液流。
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（一）双脱氧链末端终止法测序原理
Template
dNTPs
Polymerase
Primer
Terminator
A
G
C
T
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图18-3 双脱氧链末端终止法测序反应原理（1） ◄ ■ ⊃ ►
（一）双脱氧链末端终止法测序原理
A C T G G C C TAAT C G A G T C A G T
单色荧光标记法与多色荧光标记法的异同点：
• 均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法 • 单色荧光标记法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩 增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳 • 多色荧光标记引物法需将A、C、G、T四个反应分别在不 同扩增管中进行，电泳时可合并在同一泳道中电泳 • 多色荧光标记终止底物法可将A、C、G、T四个反应在同 一扩增管中进行，电泳时在同一泳道中电泳
Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法
都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某 一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度 的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片 段的分离和检测，从而获得DNA序列 双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故 在全自动DNA测序仪中应用广泛
第十八章 全自动DNA测序仪 和蛋白质自动测序仪
前
言
了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和 治疗疾病，是生命科学的核心内容之一 核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要 大分子，其结构或功能异常是导致遗传性 疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关 因素，是生命科学研究的主要对象
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前
言
核酸分子携带生命活动的全套信息，其基 本结构―核苷酸的线性排列构成它的一级 结构
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（三）荧光标记DNA的检测原理
测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应，绝大 多数产物均为单链 反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序 仪中开始电泳 两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高 分子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次 通过检测窗口 由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检 测区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA 片段
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（一）仪器的组成
主机： 主要包括电泳系统、激光器和荧光检 测系统 ；大致可分为自动进样器区 、凝胶 块区 和检测区等结构功能区
微型计算机 各种应用软件
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（一）仪器的组成 -- PE310 基因分析仪
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