一、全自动DNA测序仪的检测原理
（二）新生链的荧光标记原理
1. 多色荧光标记法 将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上。 反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带有 荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时， 也使该片段端标上了一种特定的荧光染料。 经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判 断所代表的不同碱基信息。 2. 单色荧光标记法 单色荧光标记法所用荧光染料仅一种，与多色荧光标记法 不同的是，单色荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均 需将A、T、C、G四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳 时各管产物也分别在不同泳道中电泳。
2. 变温气流式实时荧光定量PCR扩增仪 PCR扩增样品槽被设计成可以 旋转的类似离心转子的结构， 借助空气加热，转子在腔内旋 转。 样品孔之间的温度差异小于 0.01℃，加热均匀。 激发光源采用寿命较长的发光 二极管（LED）冷光源。
3. 各孔独立控温的实时荧光定量PCR扩增仪 不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控 温，可以在同一台定量PCR仪上分别进行不同条件的定量 PCR反应， 随时利用空置的样品槽开始其他定量PCR实验，使用效率 非常高。 升降温速度高达10℃/s，控温精度高。 每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接 触，保证荧光激发和检测不受外界干扰。 整合多通道光学检测系统，能有效分辨多种荧光染料，可 对同一样品进行多靶点分析，同时检测四种荧光信号。
缓冲系统：
（三）TaqMan荧光标记探针实时PCR技 术的基本原理 在普通PCR反应体系中加入了 TaqMan荧光标记探针
•TaqMan荧光标记探针特点：
探针序列能与待测模板中部某段序列互补结合； 探针的5＇端标记荧光报告基团，3＇端标记荧光淬灭基团。 完整的探针因荧光报告基团和荧光淬灭基团距离过近而使荧 光报告基团发射的荧光被淬灭； 当探针被降解时，荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，这时 才能发射出荧光，被荧光检测器所检测到。 •Taq DNA聚合酶在具有5＇→3＇方向的聚合酶活性的同时， 还具有5＇→3＇外切核酸酶活性。 •在实时荧光PCR的反应过程中，变性步骤完成后在Taq DNA 聚合酶的作用下，从引物的3‘端开始复制新链，当复制到探 针的5’端时会逐一水解探针的每一个核苷酸。
•TaqMan探针上的荧光报告基团和荧光淬灭基团会彼此分离， 荧光淬灭基团对荧光报告基团的淬灭作用解除，荧光报告基团 在激发光的激发下会产生一次荧光。 •在反应过程中，每一次PCR循环都会产生一次荧光，随着 PCR循环次数的增加，会出现荧光量的积累。 •实时PCR的结果以阈值循环数（Ct值）的形式给出，Ct值的 大小与模板DNA的起始拷贝数成反比，起始模板量越高，Ct 值越小，反之则Ct值越大。 •用于荧光报告基团的有6-羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基 荧光素（TET）、六氯-6-羧基荧光素（HEX）；用于荧光淬 灭基团的是6-羧基-四甲基罗丹明（TAMRA）。
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
No. of Cycles 1 2
No. Amplicon Copies of Target 2 4
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
3
4 5
8
16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
6 20 30
7 cycle = 128 Amplicon
总结：PCR扩增体系的5要素：
模板 引物 原材料：dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、 dGTP） Taq酶
三、PCR扩增仪的性能与临床应用
（一）PCR扩增仪的性能
3. 其他性能 （1）样品基座容量和样品数 多数PCR扩增仪配备了可更换的多样式样品基座，匹配不 同规格的样品管。 （2）软件功能： 新型的PCR扩增仪都常规使用优质配套软件，此类软件易 学易用，还具有实时信息显示、记忆存储多个程序、自动 倒计时及自动断电保护等功能。
三、PCR扩增仪的性能与临床应用
（一）PCR扩增仪的性能
1. 温度控制 （1）温度的准确性： PCR扩增仪运行过程中，放置PCR反应管的样品孔实际温 度与设定温度的一致性，是PCR扩增仪最重要的性能指标。 一般要求显示温度和样品实际温度差精确到0.1℃。 （2）温度控制的均一性： 指样品孔之间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结 果的一致性，一般要求样品孔基座温差小于0.5℃。 （3）升降温的速度： 升降温的速度是指在高温变性、低温退火和适温延伸三个 温度之间温度变化的速度。升降温速度快。
TaqMan实时荧光定量PCR
（四）双链DNA交联荧光染料实时PCR技术的基本 原理
SYBR GreenⅠ是一种可以非特异性地结合在双链DNA小 沟的荧光染料，它能嵌合在DNA双链间，不能结合在DNA 单链内。
SYBR GreenⅠ
SYBR GreenⅠ在游离状态时，发出微弱的荧光，在PCR 反应体系中加入SYBR GreenⅠ荧光染料，当它结合到双 链DNA上时就会产生很强的荧光。
三、PCR扩增仪的性能与临床应用
（一）PCR扩增仪的性能
2. 荧光检测 （1）荧光检测范围： 一般要求达到101～1010 DNA（RNA）拷贝/ml。 （2）仪器检测通道数量： 以4个通道检测的居多，部分仪器具有6个检测通道。 （3）Ct值精密度： cycle threshold, Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设 定的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的 起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值 越小。 Ct值的变异系数（CV）≤2.5%。
二、PCR扩增仪的结构与工作原理
2. 变温金属块式PCR扩增仪 主要结构特点是在同一个金属 块上完成高温变性、低温退火 和适温延伸三个温度的交替变 化。
金属块的材质主要是铝合金或 不锈钢，上面有放置PCR反应 管凹孔
温度控制方式有两种：压缩机 控温，半导体控温。
二、PCR扩增仪的结构与工作原理
（四）双链DNA交联荧光染料实时PCR技术的基本 原理 在一次PCR循环过程中，高温变性时荧光强度很低， 适温延伸结束时荧光强度明显增高。随着PCR循环 次数的增加也会出现荧光量的积累，可以达到相对 定量模板的目的。
二、PCR扩增仪的结构与工作原理
（一）普通PCR扩增仪的结构与工作原理 1.水浴式PCR扩增仪
5. 原位PCR扩增仪
在细胞内进行PCR扩增，而组织细胞的形态不被破坏，它 是原位杂交与PCR技术的结合。
原位PCR仪样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可 垂直放置一张载玻片（玻片上预制有细胞悬液、组织切片 等）。 每张载玻片面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，温度控 制精确。
在普通PCR扩增仪的基础上增加一个原位PCR模块，更换 后就可以进行原位PCR扩增。
第十四章 临床分子生物学检验常用仪器与技术
王瑞雪 山西大医院
目 录
第一节 PCR扩增仪
第二节 全自动DNA测序仪 第三节 核酸自动化提取系统 第四节 蛋白质测序仪
第一节 PCR扩增仪
（一）PCR扩增仪的分类 •普通PCR扩增仪又称为定性PCR扩增仪 梯度PCR扩增仪 实验目的 原位PCR扩增仪。 水浴式PCR扩增仪 根据变温方式 变温金属块式PCR扩增仪 变温气流式PCR扩增仪 •荧光定量PCR扩增仪
（二）PCR技术的基本原理
PCR扩增仪的基本原理是体外DNA片段扩增。 高温变性，是双链DNA加热到94℃左右，并保持一定时间 后，双链之间氢键断裂解开螺旋成为两条单链DNA，这两 条单链DNA均可与引物结合作为PCR扩增的模板。 低温退火，是当温度降至55℃左右，两条引物分别与已经 变性的两条单链DNA片段按碱基互补的原则结合。 适温延伸，是在适宜的温度（72℃左右）下，在耐热DNA 聚合酶（Taq酶）、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、 dGTP）及PCR反应缓冲液存在的条件下，以引物的3‘端 为起点，按A—T、C—G碱基互补的原则，以单链DNA为 模板进行DNA片段半保留复制。高温变性、低温退火和适 温延伸三个步骤为一次PCR循环。
3. 变温气流式PCR扩增仪 依据空气气流的动力学原理，以冷热气流为介质对PCR管 进行升降温，实现三个温度循环。 加热方式是由金属线圈加热，降温是由压缩机制冷降温。 以空气为介质，与PCR管严密接触，温度均一性好，升降 温速度快。
二、PCR扩增仪的结构与工作原理
4. 梯度PCR扩增仪 梯度PCR扩增仪的结构与变温金属块式PCR扩增仪的结构 基本相同，在温度控制环节增加了梯度功能。 使用梯度PCR扩增仪，可以对PCR反应中的高温变性、低 温退火和适温延伸三个温度循环中的任何一个温度进行梯 度实验。 PCR反应能否成功，退火温度十分关键，需要室验人员多 次摸索。梯度PCR仪可以实现一次PCR实验就可以摸索出 最合适的反应条件。多种温度可在一台扩增仪上同时完成， 既节省时间、提高实验效率，有节约实验成本。
三、PCR扩增仪的性能与临床应用
（二）PCR扩增仪的临床应用
1. 在感染性疾病中的临床应用 （病毒、细菌、寄生虫、耐药 基因等） 临床应用最广泛的是乙型肝炎病毒DNA（HBV DNA）和 丙型肝炎病毒RNA（HCV RNA）定量检测。病毒基因变异、 AIDS、SARS、TB等的诊断和治疗中也有广泛的应用。 2. 在遗传性疾病中的应用 目前临床应用PCR诊断的遗传性疾病多为单基因遗传病， 如β-地中海贫血、镰形红细胞贫血、Huntington舞蹈病、 苯丙酮尿症、血友病等。
三、PCR扩增仪的性能与临床应用
（一）PCR扩增仪的性能