克隆亚克隆的方法 (clone-by-clone)

是以物理图谱为基础、以大插入片断克隆为单位的定向测序策略。其 方法是先构建议染色体为单位的选择合适的BAC
或YAC克隆进行亚克隆测序，用计算机拼装，通过引物步移等手段填
DNA聚合酶的催化 以目的DNA为模板 按照碱基互补配对原则 在引物的引导下 单核苷酸聚合形成新DNA链

普通的PCR反应体系中，加入的 核苷酸单体为 4种2’-脱氧核苷三 磷酸（dATP，dCTP，dGTP， dTTP）
dNTP结构示意图

测序反应体系中，加入的核苷酸
单体为 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP）
…GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA
TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT…

荧光染料 标记法
单色荧光标记法
荧光标记引物法
荧光标记终止底物法 荧光标记引物法 荧光标记终止底物法
多色荧光标记法
5
多色荧光标记法 -- 荧光标记引物法

定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5’端

一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光 染料颜色不同
测序反应中，模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物等 按A、T、C、G编号被置于4支微量离心管中，A、T、C 、G四个测序反应分管进行，上样时合并在一个泳道内电 泳。特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底 物保持对应关系
补BAC内的空洞，形成一条完整的BAC序列。然后参照物理图谱，将 相互关联、部分重叠的BAC克隆联成一个大的重叠群(Contig)。但一些
长串联的高度重复序列区域和克隆或测序所不能获得的区域，仍会存
在一些物理空洞（Physical Gap）。与Shot-gun方法相比较，Clone by Cllate
dNTPs
Polymerase Terminator
Primer
A
G
C
T
双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）
A C T G G C C TAAT C G A G T C A G T
T TGACCGGAT
C
C C A A C T
G
G
T T G
T
A
G
C
G C
T
G
T A
A
双脱氧链末端终止法测序反应原理（2）
特点

重现性好，所用试剂简单，易于掌握；
所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA 序列效果较好； 序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝； 可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况， 通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA的二级结构及蛋白质-DNA相互作 用。
•
转录图谱
利用EST（expressed sequence tags 表达序列标签）作为标记所构建的 分子遗传图谱
•பைடு நூலகம்
序列图谱
通过基因组测序得到的，以A、T、G、 C为标记单位的基因组DNA序列
• 物理图谱的构建
• 大片段克隆的筛选
• 霰弹法测序与“工 作框架图”的构建
• 序列的全组装与 “完成图”构建



无需延伸反应及克隆
更适于含有稀有碱基或GC含量高及短链寡核苷酸的测序，可双向标记并 测序。 比较繁琐费时，过长序列有困难。

12
13
14
（一）双脱氧链末端终止法测序原理

利用DNA的体外合成过程－－聚合酶链反应（polymerase
chain reaction, PCR）

Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法

都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某 一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度 的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片
段的分离和检测，从而获得DNA序列

双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故



DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发 射出特征波长的荧光
代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射 到CCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算 机加以处理 整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信 号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度 为纵轴的信号数据的集合 经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结 果以一种清晰直观的图形显示出来
的精细物理图谱的构建是技术性极强的工作；并且测序费用和所需的
时间也相对较多。
人类基因组计划研究的主 要成果和进展表现在这 “四张图”
• 遗传图谱
又称为连锁图谱（linkage map）， 指基因或DNA标志在染色体上的相对 位置与遗传距离
•
物理图谱
以定位的DNA标记序列如STS作为路 标，以DNA实际长度即bp、kb、Mb 为图距的基因组图谱。


荧光标记引物法
Primer Primer Primer Primer
A
G
C
T
图18-8 荧光标记引物法原理
多色荧光标记法 -- 荧光标记终止底物法
定义：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷 酸上
反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带 有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的 同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料 经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来 判断所代表的不同碱基信息



A
G
C
T
模板：T C C A T G A T 产物：A G AG G AGG T AGGT A AGGTA C AGGTAC T AGGTACT A
新生链的荧光标记原理
荧光标记引物法和荧光标记终止 底物法的异同点：


都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专 一对应关系 荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的 端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同 一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中， 而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔 荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一 时间完成 在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而 后者的四种反应可以在同一管中完成



多色荧光标记技术检测优点：

一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳
，避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精 确度的影响，提高了测序精度

一个样品所有反应产物只需进样一次，所以一次实验便可
以处理较之手工方法更多的样品。在相同样品数的情况下
，加样的工作量也大大减少
DNA序列测定的策略


单色荧光标记法

也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法 与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法 和荧光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个 反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物 也分别在不同泳道中电泳

单色荧光标记法与多色荧光标记法的 异同点：
均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法
ddNTP结构示意图
PCR（聚合酶链式反应）原理
反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液 每个循环包括：变性（90℃）、退火（54 ℃）、延伸（72 ℃）

与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟
基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过
其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH 发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它 们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键 ，从而使正在延伸的DNA链在此终止。

单色荧光标记法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增 管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳

多色荧光标记引物法需将A、C、G、T四个反应分别在不同 扩增管中进行，电泳时可合并在同一泳道中电泳
多色荧光标记终止底物法可将A、C、G、T四个反应在同一 扩增管中进行，电泳时在同一泳道中电泳

（三）荧光标记DNA的检测原理
克隆亚克隆的方法 (clone-by-clone)

全基因组散弹法(鸟枪法) (whole-genome shotgun method)

两种大规模基因组测序策略的比较
策 项 目 遗传背景 速度 费用 计算机性能 适用范围 代表测序物种 全基因组霰弹法 不需要 快 低 高（以全基因组为单 位进行拼接） 工作框架图 果蝇、水稻 略 逐步克隆法 需要（需构建精确的 物理图谱） 慢 高 低（以BAC为单位进 行拼接） 精细图 人、线虫
在全自动DNA测序仪中应用广泛
Maxam-Gilber化学降解法


原理
一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分别得
到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱 基。因此生成4种放射性标记的分子，从共同起点（放射性标 记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有 长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在
第十四章 全自动DNA测序仪和 蛋白质自动测序仪
“基因组”----生命科学的“元素周期表 ”
元素周期表
元素周期表的发现奠定了二 十世纪物理、化学研究和发展的 基础