测器，检测方向与激发光成直角。
由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发波 透光强度为I；荧光物质被激发后，发射荧光F。 为消除入射光的影响，荧光测量通常在与激发光 成直角的方向上进行。
长I0，经样品池后，一部分光能被荧光物质吸收，
第二发射单色器的设置是为了消除可能共存的
其它光线的干扰，如散射光以及溶液中其它杂 质所发生的荧光，以获得所需要的荧光，让其 作用于检测器上，得到相应的电信号，经放大 后作记录。 §3-5 分子荧光光度法的特点及应用
一.荧光光度法的特点 1.灵敏度
与紫外—可见光度法比较，荧光法检测是在
黑背景下进行，所以其灵敏度要高出2∼4个
数量级，测定下限为0.1∼0.001g/mL。
2.选择性强
荧光法既能依据特征发射又能依据特征吸收
来检定物质。如某几个物质的发射光谱相
似，则可从激发光谱的差异来区分；而如果
它们的激发光谱相同，则可通过发射光谱将
激发光谱和荧光发射
光谱的特点：
(1)荧光发射光谱与激
发波长无关，如前所述，
无论引起物质激发的波
长是1还是2，但荧光
发射波长都为3。
这是由于分子吸收了不同能量的光子可由基 态激发到不同的电子激发能级而产生几个吸收
带；由于较高激发态可通过内转换及振动弛豫
回到第一激发态的几率很高，远远大于由高能
决定于第一电子激发态中各振动能级的分布状况；
三．荧光和分子结构的关系 产生荧光的分子必须具备下列条件： (一)物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频
率的吸收结构，才能吸收激发光。
(二)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光效率。 荧光效率也称为荧光量子产率，表示物质发 射荧光的本领，为发出荧光量子数和吸收激发 光量子数的比值。
级激发态直接发射光子的速度。 故在荧光发射时，无论用哪一个波长的光 辐射来激发，电子都从第一激发态的最低振动 能级返回到基态的各个振动能级，所以荧光发
射光谱与激发波长无关，只出现一个荧光谱带。
(2)荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关
系
将某一荧光物质的荧光光谱和它的吸收光
谱对比时，将发现这两个光谱间呈镜像对称关系。
效率成正比：
F Ia
根据Beer定律：A=lg(I0/It)=bc Ia=I0-It=I0· (1-10-bc) 代入上式： F I0 (1 e2.303 bc ) 式中I0是激发光强度, 是摩尔吸光系数, b 是 液层厚度, c是样品浓度。
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又∵ e2.303 bc
值一般＜1，如罗丹明B的乙醇溶液，=0.97； 蒽乙醇溶液的=0.30；菲乙醇溶液的=0.10。 有许多吸光物质不发荧光的原因在于激发态 分子释放激发能（去活化）过程中，除荧光发射 以外，还有许多非辐射跃迁与之竞争。显然荧光 效率与物质结构以及所处的环境密切相关。
什么样的物质会发生荧光?
激发光谱与吸收光谱不仅形状相同,而且波
长位置也一样,这是因为物质分子吸收能量的过
程就是被激发的过程.
二.荧光发射光谱 简称荧光光谱或发射光谱。如果将激发光波 长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长， 测定不同发射波长处的荧光强度，即得到荧光发
射光谱。下图为萘的激发光谱、荧光发射光谱和
磷光发射光谱。
上式仅适用于稀溶液，对于较浓的溶液，
其bc超过0.05时，F与c的线性关系将发生偏离。 由于浓度过高，使荧光物质分子间以及荧
光物质分子同溶剂分子间的碰撞增加，导致无
辐射去活增加而发生自熄灭。 另外在荧光发射波长同化合物的吸收波长 有重叠的情况下，物质发射出的荧光可能有部
分被自身吸收，造成结果负偏差。
时间经紫外光照射，其F值没有显著变化；但
如果溶液的浓度在0.02g/mL以下时，F值就有
显著变化。
二.溶剂 同一种荧光物质在不同溶剂中，其F值和荧 光光谱都可能有显著不同。一般荧光峰的波长 随溶剂介电常数的增大向长波长方向移动，即 增大。
但也有相反的情况，如苯氨萘磺酸在戊醇、 丁醇、丙醇、乙醇、甲醇中,随极性，；且 荧光光谱的位置与F和溶剂极性之间的关系没有 明显的规律。 三.温度 温度对荧光强度的影响较敏感。一般来说， 温度，荧光强度。如荧光素的乙醇溶液在 0℃以下，每降低10度，荧光效率约增加3%。
其原因在于它们的分子和离子的电子构型不同。 如苯胺在pH=7∼12的溶液中会发出蓝色荧光， 而在pH2或13的溶液中，都不发荧光：
上式表明能发射荧光的是苯胺分子，而苯 胺离子是不发射荧光的。 金属离子与有机试剂形成的荧光化合物受 pH值的影响更大。
pH一方面影响配合物的形成，另一方面影响配 合物的组成。
第三章 分子荧光光度法
§3-1 分子荧光概述 分子荧光法的分 析一般都在溶液 中进行，如前所 述每个分子都具
有一系列严格的
分立能级：
图中S0表示分子
的基态，S1、S2
分别为第一激发
单重态和第二激
发单重态；T为激
发三重态；基态 和激发态都存在 几个不同的振动 能级。P.82
物质吸收了电磁辐射并发射出荧光的过程中 大致会经历以下几个过程：
(4)体系间的系间窜跃：
受激分子从激发单重态转至能量较低的激发
三重态的过程称为系间窜跃。
如果两个能态的振动能级重叠时，这种跃 迁的几率较大；这些处于激发三重态的分子， 继续通过辐射光能而回到基态单重态的各振动 能级，所发出的辐射称为磷光。 由于不同物质的分子结构及分析时所处的
化学环境不同，因此各去活化过程的速度也就
但很多无机阳离子能与一些有机试剂形成荧光 配合物而被测量。目前以形成荧光配合物方式 进行测定的元素达到了60余种。而常采用该方 法测定的元素主要有Be、Al、B、Ga、Se、Mg 及某些稀土元素。 某些阴离子如氟、氰等的存在能使共存物 质的荧光减弱，即所谓的熄灭效应，根据这一 效应可测定氟和氰等离子的浓度。
(2.303 bc)2 (2.303 bc)3 1 2.303 bc 2! 3!
当bc≤0.05时，可略去第二项后的各项。 ∴ e-2.303bc =1–2.303bc F=I0∙(1–e-2.303bc) F=I0∙[1–(1–2.303bc)]=2.303I0bc 当激发光(入射光)强度I0一定，并且浓度c 很小时，荧光强度F与荧光物质浓度c成正比。 即： F=K· c
其区分。
3.试样量少，方法简便
因灵敏度较高，所以试样用量较少，如采用微 量池测定，用量仅为10L。 4.提供较多的物理参数 该方法能提供激发光谱和发射光谱以及荧光强 度、荧光效率、荧光寿命等许多物理参数。
这些参数反映了物质的各种特性，从不同的角
度提供被研究的分子的各种信息。
荧光法的缺点是它的应用范围还不够广泛。 原因：(1)本身能发荧光的物质相对较少。可采 用加入某种试剂的方法将非荧光的物质转化为 荧光物质进行分析；(2)由于方法灵敏度高，测 定时对环境较敏感，所以干扰因素也较多。 二.荧光分析法的应用 1.无机物分析 无机离子中除少数离子外，一般不发荧光。
吸收光谱是物质分子的外层电子由基态激
发至第一电子激发态的各振动能级所致，其形状
荧光光谱是激发态分子从第一电子激发态 的最低振动能级回到基态中各振动能级所致， 其形状决定于基态中各振动能级的分布状况； 而第一电子激发态中各振动能级的分布与基 态中各振动能级的分布相类似，因此荧光光谱与 吸收光谱形状相似，并呈镜像对称关系。
如镓离子与邻苯二羟基偶氮苯在pH3∼4的
溶液中形成1:1配合物，产生荧光。但在pH6∼7 的溶液中则形成1:2配合物，不产生荧光。 §3-4 荧光光度计 荧光分析所用的仪器种类很多，简单的有目 测荧光计，光电荧光计等。较精密的有荧光分光 光度计；它们的结构、功能和价格差别很大。
组成荧光光度计的有四大部分：激发光源、样 品池、 测量荧光的检测器及用于选择激发波 长和荧光波长的滤光片或单色器。
不同。如果荧光发射过程比其他去活化过程的
速度快，就可看到荧光发射现象；相反，则看
不到荧光，或其强度减弱。
§3-2 荧光分析法定量依据
任何荧光化合物都具有两个特征光谱：激发 光谱和发射光谱。它们是荧光定性和定量分析的
基本参数和依据。
一.激发光谱 以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐 标，绘得的谱图称荧光化合物的激发光谱。 绘制激发光谱曲线时，在荧光的最大发射波 长处，改变激发光波长来测量相应的荧光强度。
实验表明：
1.具有共轭双键结构体系的分子容易发荧光；其
共轭度愈大，电子越易被激发,分子的荧光效率
也越大，荧光发射光谱向长波长方向移动。
2.具有刚性平面结构的分子，具有较强的荧光。 这两个物质的荧光效 率分别为1.0和0.2。
这是由于加入了亚甲基使芴的刚性和共平面
性增大的缘故。这种结构可减少分子振动，即减
之则荧光减弱。
了解荧光和物质分子结构的关系，可以帮 助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质， 或将荧光强度不大或选择性不高的荧光物质转
化为荧光强度大及选择性高的荧光物质以提高
分析的灵敏度。
四.荧光强度和溶液浓度的关系 按荧光发生机理，可得到溶液的荧光强度
和该溶液吸收光的强度Ia以及荧光物质的荧光
1.激发：
通常在室温下，大部分分子处于基态的最 低振动能级，含有偶数个电子且自旋配对，处 于基态单重态(sinlet state；Pauli原理)；当 其吸收一定频率的电磁辐射(光量子)后电子可 发生能级跃迁至第一激发单重态(S1)，这一过程 称为激发。
2.去活化过程： 处于激发态的分子是不稳定的，可通过几 种不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。 去活化过程主要有以下几种：
温度增加，荧光效率下降的主要原因是分
子内部能量发生变化，溶质与溶剂分子之间的 碰撞机会增大，把能量消耗了。 四.溶液pH值的影响 如果荧光物质本身为弱酸或弱碱时，溶液