肿瘤免疫学研究某些新进展于益芝　曹雪涛 近年来,随着免疫学基础理论研究的迅速发展,尤其是对人类肿瘤抗原的确认及M HC Ⅰ类分子参与的抗原加工和提呈分子机制等的深入研究,肿瘤免疫学基础理论研究以及相应的肿瘤免疫治疗研究均取得了较大进展。

由于肿瘤免疫的进展太快且内容十分丰富,本文仅对肿瘤免疫学领域中(肿瘤免疫诊断除外)研究进展较突出的几个方面包括T细胞识别的人类肿瘤抗原、M HC分子参与的肿瘤抗原的加工和提呈、效应细胞(主要是CTL)的杀伤机制以及与此相关的肿瘤免疫治疗等新进展作一简要综述。

一、T细胞识别的人类肿瘤抗原研究肿瘤抗原的研究是肿瘤免疫学研究的中心环节。

目前发现的人类肿瘤抗原有:1.肿瘤特异性抗原　有两家实验室在这方面的工作受到广泛的关注。

比利时Boon实验室克隆并鉴定出三个家族高度特异性的肿瘤抗原基因:M AGE、BAGE及GAGE。

这些基因常表达于多种类型的肿瘤包括黑色素瘤、肺癌、肉瘤、膀胱癌等细胞,但很少在其它肿瘤如脑瘤、肾癌及白血病细胞上表达;正常组织中仅有睾丸及胎盘表达。

目前,通过自体黑色素瘤细胞刺激淋巴细胞后获得的C TL克隆株已鉴定出由M AGE-1、M AGE-3、BAGE及GAGE表达的六种肿瘤抗原,提呈这些抗原的HLA分子及肽段均已完全明确。

这些C TL均来自同一个具有典型临床特征且已转移的黑色素瘤患者,而在对其他表达部分或全部抗原的肿瘤患者的检测中,未能通过自体肿瘤细胞诱导出这样的CT L。

60%以上的白人黑色素瘤患者体内具有一种由M AGE或BAGE或GAGE表达的肿瘤抗原。

其它肿瘤如头颈部肿瘤及膀胱癌表达的机率为28%～40%。

研究也表明,用其中的任何一种抗原给睾丸癌患者体内免疫均未引起作者单位:200433上海,第二军医大学免疫学教研室严重的免疫方面的副作用。

Rosenberg实验室通过对患者有疗效的TIL克隆,从肿瘤(主要是黑色素瘤)患者中寻找到了如下肿瘤抗原,包括M ART-1抗原(由118个氨基酸组成,其活性九肽为AAGIGILTV)、g p100抗原(661个氨基酸,其活性多肽有三种,g9-154 KTW GQYW QV,g9～209ITDQV PFSV,g9～280YLEPGPV TA),酪氨酸酶(529个氨基酸,其活性多肽为AFLPW HRLF)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1),含527个氨基酸,其活性多肽为M SLQ RQFLR)、P15抗原(128个氨基酸,其活性多肽为SYLDSGI HF)、β-catein(781个氨基酸,其活性肽为SYLDSGIHF)。

此外,某些针对乳腺、卵巢及胰腺等肿瘤的CTL可识别一种存在于细胞表面的含有多个前后排列的20个氨基酸的多肽重复序列的粘蛋白(m ucin)表位,正常细胞上该粘蛋白中度糖基化,在这几类肿瘤中,该多肽重复片段在糖基化后暴露出来而被C TL识别,且这种识别缺乏HLA限制。

近来有学者报道红白血病细胞也存在该表位并从红白血病患者血中分离出针对该粘蛋白特异的CT L。

这些粘蛋白抗原非常特异且无HLA 限制,很有利于其临床应用。

这些抗原尤其是免疫活性多肽的发现为免疫治疗提供了新的方法,如应用肿瘤多肽抗原作体内主动免疫以治疗肿瘤患者,或应用肿瘤多肽结合到抗原提呈细胞上用于主动性免疫治疗,或应用肿瘤多肽体外致敏杀伤细胞进行过继免疫治疗、或以抗原基因为目的基因进行肿瘤的基因治疗。

2.分化抗原　正常黑色素细胞及黑色素瘤细胞上表达的分化抗原也能诱导自体C TL产生,这大大出乎许多研究者的意料。

目前已克隆出基因的黑色素瘤分化抗原有四种:Melan-A/ Ma rt-1、酪氨酸酶(Tyrosinase)、pg100及g p75。

这些抗原多肽多可以由HLA-A2提呈,但也曾发现其他HLA-多肽复合体,如一种酪氨酸酶多肽是由HLA-DR提呈给CD4+T细胞的。

这类抗原所诱导的C TL前体与M AGE等抗原所诱导的C TL前体有明显的不同。

它们在体外被自体肿瘤细胞所识别且T IL中也含有这类CTL。

有关此类抗原介导的肿瘤免疫治疗的意义尚有待于进一步探讨。

患者体内含有这些C TL前体细胞,使进一步通过主动免疫疗法以增加体内的CT L数量成为可能。

3.某种肿瘤特异的肿瘤抗原　点突变也可以产生被自体CTL所识别的肿瘤抗原。

最明显的例子是点突变所产生的细胞周期素依赖的激酶,它能阻止该蛋白与p16结合而增加其与细胞周期素及磷酸化Rb结合的可能性,这导致了E2F转化因子的释放,该因子又激活了某些能促使细胞进入S期的基因。

这种点突变既能使之具有抗原性又具有致瘤性。

这种点突变所产生的肿瘤抗原对肿瘤细胞来说理应是特异的,且体内也应存在针对这些抗原的CT L前体细胞。

但另一方面,它们只是针对某个体的肿瘤抗原,因此很难开展以此类抗原为基础的有效的肿瘤疫苗研究。

4.共同抗原　某些能被体外所诱导的CT L识别的肿瘤抗原的基因是普遍表达的。

有学者分离出6种这样的基因,其中某些在肿瘤细胞过度表达。

但这类肿瘤抗原很难应用于肿瘤的免疫治疗。

二、肿瘤抗原的加工提呈及CT L活化机制的研究M HC分子在抗原的加工提呈中的作用是近年来免疫研究中的热点之一,并取得了很大的进展。

研究表明,天然的、变性的、化学修饰的抗原均可能被抗原提呈细胞(APC)加工或酶解处理后转变为某些多肽而提呈给T细胞;T淋巴细胞不能直接识别可溶性的游离蛋白抗原,只能通过T细胞受体(TCR)识别与M HC产物结合表达于细胞表面的多肽片段。

CD4+的T 辅助细胞识别APC上与M HCⅡ类分子结合的多肽,而CD8+的细胞毒性T细胞识别靶细胞表面M HCⅠ类分子结合的多肽复合体。

但并非所有肽段均能与M HC分子结合,即使已经形成某种肽-M HC复合体,某些个体的T细胞库中也不一定存在能表达识别此复合体受体的T淋巴细胞。

目前已明确与抗原识别有关的抗原肽-M HC-TC R三元体、肽及沟槽的结构特点,对与之相关的一些结构如TCR/CD3等及一些辅助分子如共刺激分子、粘附分子等的研究也越来越深入,这些均为肿瘤免疫的研究提供了理论基础。

1.肿瘤抗原的加工与提呈　肿瘤抗原和其它抗原一样主要通过两条途径被加工处理和提呈:(一)M HCⅠ类分子限制性的抗原加工与提呈:M HCⅠ类分子的主要作用是与抗原多肽结合形成复合物并提呈内源性抗原给CD8+T 细胞,诱发特异性细胞杀伤效应。

它是由重链α和轻链β2-m以非共价键结合组成的二聚体。

重链的胞外部分有α1、α2、α3三个功能区。

α1及α2功能区形成了M HC结合多肽的沟槽状结构,大小约1nm×2.5nm×1.1nm,其两端是封闭的。

最近的报道表明,CD8αα同二聚体分子与一个HLA-A2分子结合并与β2-m接触,α3区上一活动的环(223～229个氨基酸)被CD8的两个亚基上类似互补决定区(CDR)的两个环所钳制,使第二个M HC分子不能与之结合。

内源性抗原加工过程中,完整的抗原首先在胞浆中经蛋白酶解复合物(主要是蛋白酶体)降解成多肽(8～10个氨基酸),然后转移至内质网(ER)腔内与新组装的M HCⅠ类分子结合。

其中涉及转运蛋白TAP(transpo rter a sso-ciated with a ntigen processing)。

目前认为T AP对多肽的转运过程是:多肽首先是与T AP分子孔样结构的胞浆区结合,ATP结合在T AP1和T AP2的羧基端,经水解后导致T AP异二聚体的构型改变,从而暴露膜内区的结合位点,使多肽进入内质网腔。

一个细胞每分钟大约能转运20000个多肽,足够与M HCⅠ类分子结合。

用光激活肽交联物研究发现,多肽是通过与TAP1和T AP2构成的结合域结合后才转运的。

只要有微量T AP存在即可完成对多肽的转运。

TAP对长度为8～13个氨基酸的多肽的亲和力最高,该长度与M HCⅠ类分子结合的多肽长度相近。

多肽进入ER后,有三种结果:①直接与M HCⅠ类分子结合;②由HSP等进一步修剪成为与M HCⅠ类分子结合的肽段(但在ER内降解的能力较弱);③迅速地又被转运出ER,在胞浆内(依赖于AT P)被进一步降解。

可见,多肽经过了三重筛选(蛋白酶体、T AP和M HCⅠ为分子的选择)而保证了提呈抗原的准确性和特异性。

有趣的是,编码它们的基因都位于M HC复合体内,这表明它们在进化上有共同起源。

研究细胞表面自然结合的多肽序列表明,M HCⅠ类分子结合的多肽长度为8～10个氨基酸,结构上必需含有与M HC 特异结合的多肽基序(mo tif)吻合的氨基酸;通过氨基端、羧基端的保守性氨基酸的氢键紧密地与M HCⅠ类分子沟槽结合。

抗原多肽与M HCⅠ类分子结合所形成的复合物表达于细胞表面,被CD8+的T细胞所识别。

在此过程中,热休克蛋白(HS P)的“分子伴侣”作用及其在肿瘤免疫治疗中的意义引起了人们的兴趣。

现已发现,与肿瘤抗原相关的HSP有HSP70、HSP90、HSP96等,它们既可作为抗原提呈的辅助分子,参与肿瘤抗原多肽的加工与处理且将多肽转交给M HC分子,还能作为载体,将抗原直接提呈给T细胞(γδ+ CD8+细胞)。

(二)M HCⅡ类分子限制性的抗原加工与提呈外源性的蛋白质抗原被抗原提呈细胞内吞至细胞中的腔室结构(内质体及溶酶体),在酸性环境中被蛋白酶等水解为抗原多肽片段,其中仅有小部分与M HC分子结合的多肽具有免疫原性。

在内质网中新合成的M HCⅡ类分子是与Ii(inv ariant chain,又称恒定链)连接在一起的,它在与多肽结合前由内质网转移到内质体腔,在腔内Ii被降解或解离后再与抗原多肽形成稳定的复合体,然后转运至细胞膜。

在内质体中,I i被天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等降解,只剩下CLIP片段(80～104残基)依然与肽结合槽紧密结合,随后在HLA-DM参与下,使CLIP从Ⅱ类分子上脱落,并引导抗原肽在M HC中与结合槽相互作用,部分外源性抗原也可不通过Ii依赖性途径而与M HCⅡ分子结合,而是抗原直接与胞膜表面的空载M HC Ⅱ类分子结合后,发生内化进入细胞内,在内质体中抗原被降解为多肽,随后与再循环至胞内的空载的成熟M HCⅡ类分子结合,形成稳定的多肽-M HCⅡ类分子复合体,转运至细胞膜。

这一途径中,Ⅱ类分子α或β链胞浆尾部对内化的发生起了重要作用。

抗原多肽与M HCⅡ类分子结合所形成的复合物表达于细胞表面,被CD4+的T细胞所识别。

(三)其它途径　近期的研究表明,M HC 分子对内源性和外源性抗原的提呈途径并非是绝对的,M HCⅠ类分子也能提呈外源性抗原,同样,M HCⅡ类分子也能提呈内源性抗原。

此外,最近还有学者对第三类抗原提呈分子小鼠CD1的晶体结构进行了研究,发现CD1采用类似M HC(特别是M HCⅠ类分子)的折叠方式与多肽连接,其结合多肽的沟槽状结构尽管窄些,但更深,因而面积显得更大,且含有两个疏水性的袋状结构。