金氪研究-液体活检的检测对象导语继上次金氪平台推送了液体活检行业篇的第一部分后，本文将继续介绍液体活检的检测对象。

目前，液体活检的三种主要肿瘤来源的生物标志物分别是循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、肿瘤外泌体。

液体活检的检测对象液体活检是指通过非侵入性取样，如血液、唾液、尿液等，利用高通量测序技术、过滤、捕获或富集体内肿瘤细胞的基因组信息，把握住癌症的蛛丝马迹，从而对疾病进行动态的观察和治疗，是一种突破性的革新技术。

液体活检的检测样本、对象及其临床应用资料来源：Clin Cancer Res; 23(10) May 15, 2017目前，液体活检的三种主要肿瘤来源的生物标志物分别是循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、肿瘤外泌体。

CTC是由原发灶或转移灶释放的，进入外周血循环的肿瘤细胞，侧重于细胞病理，适用于治疗后的病情监测，判断预后等；外泌体所含信息丰富，包括蛋白质，RNA等，不仅能用于临床诊断，还有可能用于疾病的治疗；ctDNA是肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA，可通过检测ctDNA的突变信息和甲基化，进行定性和定量分析，适用于早期筛查，个性化用药指导，耐药性监测等。

除了以上三种生物标志物，循环肿瘤miRNA也可作为液体活检的检测对象。

miRNA由于尺寸较小且能免于RNA 酶介导的降解，致使其在血液或其他体液中通常比较稳定。

最近的研究表明在诊断结肠癌时，miRNA表现出比ctDNA更优越的敏感性和特异性。

然而，miRNA 能否作为临床上诊断癌症的生物标志物，仍需要克服一些障碍，尤其是不能追溯肿瘤组织来源，以及不能确定是否能够在临床上标准化。

CTC技术的弊端在于血液中CTC的含量极少，且不易提取，其应用范围由此受到了较大限制；外泌体技术目前仍处于早期科研阶段，距大范围市场应用还有较长周期。

ctDNA技术手段较为成熟，临床应用最广泛，尤其是在肿瘤早期筛查领域潜力巨大，此外，ctDNA甲基化检测能提高敏感性，且能用于肿瘤定位，判断肿瘤来源。

因此，综合技术的成熟度、应用范围的广度、测序成本的合理性等考虑，ctDNA技术是目前最主流的液态活检技术。

CTC、ctDNA和外泌体三种技术的比较资料来源：宽华集团投研部整理CTC临床潜力巨大，但捕获难度大，大多数应用局限于研究目的1869年Ashworth首次提出循环肿瘤细胞(CTC)的概念，CTC是由自发或诊疗操作由原发或转移肿瘤中，获得脱离基底膜的能力并进入血液循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。

根据其细胞类型的不同，可将CTC分为上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮间质细胞混合表型。

通过监测CTC类型和数量变化可以实时评估肿瘤动态与治疗效果，有望实现个体化精准用药。

CTC的发展历史资料来源：宽华集团投研部整理CTC 是活体肿瘤细胞，可通过计数实现早期筛查和复发监控，亦可通过分离培养和全基因组测序实现指导治疗方案和治疗监测。

可在基因组、转录组、蛋白组和代谢组水平分析CTC特性，在癌症的诊断和治疗领域拥有最广阔的发展潜力。

CTC的半衰期不超过2.4个小时，仅有少数具有高活性的CTC能存活下来，并有机会在患者其他组织器官中形成转移灶。

血液中的CTC含量稀少，1ml血液中含有数十亿个细胞，其中仅包含1个CTC，所以CTC检测的主要挑战是如何对CTC进行捕获。

现阶段CTC捕获技术的灵敏度和捕获效率低，漏检率高，因此CTC的大多数应用局限于研究目的，目前还没有建立临床实践。

CTC在癌症治疗中的应用场景资料来源：参考浙商证券基于外泌体的液体活检技术需进一步观望血液中外泌体含量高，稳定强、可长期存储。

大多数细胞在正常和病理状态下均可分泌外泌体，肿瘤细胞外泌体即肿瘤细胞脱落的囊泡，携带肿瘤细胞的DNA、RNA和蛋白质等信息，在细胞间物质和信息转导中具有重要作用。

外泌体可介导肿瘤细胞增生、免疫耐受和化学抵抗，促进肿瘤血管形成，且其miRNA 有望成为肿瘤诊断的新型标志物。

与ctDNA和CTC相比，外泌体具有易于富集、稳定性高且不易降解的特性。

据悉在冷库中储存30年的血液也可用于分离检测外泌体，因此可用外泌体建立肿瘤细胞进化发展史“活日记”，记录患者肿瘤组织在治疗过程中产生的一系列遗传信息和蛋白表达的变化情况，便于病情和治疗追踪，可用于癌症的诊断和复发监控。

目前基于外泌体的液体活检技术尚处于起步阶段，但是外泌体凭借其易富集、稳定性高等优势，已获得极高的关注。

关于外泌体的文献报道层出不穷，以2015年发表在《自然》杂志上关于利用Glypican-1蛋白作为早期胰腺癌的诊断标准为首。

外泌体最先可被应用于癌症早期诊断中，但由于科研成果转化中存在不确定性，技术成熟时间仍需观察。

ctDNA技术是目前最主流的液态活检技术1948年，科学家首次报道发现了人类血液中循环的DNA（cell-free DNA, cfDNA）；1977年，发现血液中循环的DNA在癌症患者中尤为显著。

ctDNA是指肿瘤细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡、坏死后释放进入循环系统，游离于细胞外的由肿瘤细胞释放的小片段游离DNA，是cfDNA的一部分。

健康人血液中的cfDNA含量极低，通常为10-15 ng/ml，不容易检测到。

而癌症病人血液中，根据其病情阶段，可以检测到含量不等的cfDNA或ctDNA。

1ml血液中约含有0.08-38 ng ctDNA。

ctDNA的半衰期非常短，一般不超过1.5小时。

ctDNA的发展历史资料来源：宽华集团投研部整理ctDNA携带着肿瘤细胞中的基因突变和表观遗传学改变信息，包括点突变、DNA甲基化、序列重排、拷贝数差异（copy number variation, CNV）等，其在人体血液循环系统中不断流动，可实时反映肿瘤患者当前信息。

对ctDNA 的分析包括定性和定量的分析，其中定性分析包括检测基因突变、缺失、插入、融合、重排、拷贝数变异、甲基化、微卫星不稳定（MSI）和杂合性缺失（LOH）等；定量分析就是计算ctDNA 在血液中实时的含量。

定性和定量两种方法均可以反映肿瘤的存在和严重程度。

在液体活检的三种监测对象中，ctDNA技术手段较为成熟，目前已被临床逐渐运用到了从肿瘤的最初诊断到治疗、发展的各个阶段，包括：早期筛查，评估肿瘤的异质性，转移复发风险和预后评估、实时监控治疗反应和耐药，肿瘤分期分级和指导治疗方案选择等。

（1）早期筛查：当肿瘤生长到一定阶段，会向血液循环释放ctDNA，通过检测ctDNA能对癌症早期病人甚至是癌前病变病人进行筛查，该方法能早于传统的癌症筛查手段发现癌症；在ctDNA的众多临床应用中，由于癌症早期筛查为疾病预防重要手段，能有效降低病人死亡率，其市场潜力巨大（据Piper Jaffray测算，2026年液体活检在早期筛查领域的全球市场容量为150亿美元），目前已经有多家公司布局该领域。

（2）评估肿瘤的异质性：肿瘤细胞具有时空异质性，同一病人的肿瘤细胞不尽相同，相同细胞随着疾病进展也会发生变化；通过穿刺等方式取得的少量组织样本，有时难以代表全部肿瘤组织，而ctDNA可以综合来自全身肿瘤组织裂解释放的ctDNA，从而克服肿瘤的空间异质性，并且由于采样的无创特性，可以动态监测克服肿瘤的时间异质性；（3）转移复发风险评估：肿瘤转移和复发是肿瘤致死的主要原因，对于多数肿瘤，若能早期检测到转移复发，患者还有很大的治疗机会，但传统影像学检测目前不能对肿瘤转移和复发早期预警；癌症复发早期，血液中ctDNA会增加，通过ctDNA检测可对转移和复发风险进行评估；（4）预后评估：ctDNA的含量、突变状态、甲基化情况等都能预测病人的预后；（5）实时监控治疗反应和耐药：患者接受某种治疗受益一段时间后，往往会因为基因的二次突变出现耐药，通过检测ctDNA的突变信息能够动态监测耐药发生，同时ctDNA浓度的动态变化可反映治疗效果，通过ctDNA检测也可进行实时连续监测治疗效果；（6）肿瘤分期分级：在癌症突变的不同阶段，ctDNA突变情况和含量都可能会不同，有助于医生判断病人的肿瘤进展，如II-IV期非小细胞肺癌病人的血液中100%能检测到ctDNA，而I期病人只有50%能够检测到；（7）指导治疗方案选择：同一种癌症的突变不同，对不同药物反应各异；FDA 目前已经批准了大量根据肿瘤基因型突变的癌症个性化用药指导方针，分析血液ctDNA可以帮助医生判断病人肿瘤的突变类型，制定用药方案。

ctDNA包含的信息和在临床中的可能应用资料来源：M.Yang et al. Annals of Oncology 29: 311–323, 2018目前，ctDNA的检测主要集中在两个方面：基因突变和甲基化。

突变检测在靶向药的敏感性和抗耐药性方面具有一定的优势，而甲基化检测在早期诊断、预后监测以及后续的疗效判断方面具有一定的优势。

甲基化检测较突变检测的优势表现在两个方面：（1）检测的灵敏性方面，甲基化较高。

一个癌症病人至少具有几百万个癌细胞。

在这几百万个癌细胞中，突变都是不一样的，具有很大的细胞间异质性。

而且不同病人的突变也是不一样的。

很多突变的异质性决定了它的敏感性很低。

例如，一个很常见的突变可能在一个病人的ctDNA中可能只有10%，最多20%，也就是说80%的病人是检测不到突变的。

甲基化则不同，正常细胞在癌变过程中，首先必须在一个特殊的位点进行甲基化或者去甲基化修饰，这是100%概率的事件，只要能测出来便可以判断是不是有肿瘤。

（2）甲基化可以实现肿瘤定位。

同一个突变可能在不同类型的肿瘤中都会发生，比如KRAS突变和Myc突变在肝癌、肺癌或肠癌中均可以检测到，所以不可能用突变进行定位。

而特定的甲基化位点在不同的肿瘤中都是不同的，所以可以用来做肿瘤定位。

小结CTC、ctDNA和外泌体虽然都是液态活检的检测对象，但各有特色。

CTC 是活体肿瘤细胞，可通过计数实现早期筛查和复发监控，亦可通过分离培养和全基因组测序实现指导治疗方案和治疗监测。

CTC临床潜力巨大，但是捕获难度大，大多数应用局限于研究目的。

外泌体具有易于富集、稳定性高且不易降解的特性，但由于科研成果转化中存在不确定性，技术成熟时间仍需观察。

ctDNA 检测主要分析基因突变或者甲基化变化情况，其技术手段成熟，临床应用广泛，尤其是近年来在癌症早筛的应用中取得了较大进展，得到了科学家、企业和投资机构的青睐。

但是ctDNA侧重基因层面，所含信息量少，癌症早期的检出率仍有待提高。

目前，已经有研究者或公司将多种标志物结合起来用于癌症的检测，如年初发表于《Science》杂志的Canerseek技术将DNA突变和几种蛋白标志物结合起来用于癌症筛查；癌症早筛公司Grail通过检测体细胞突变，拷贝数变化和甲基化三种指标，全面描述癌症特异性ctDNA信号。