（二）工程菌发酵工艺
基因工程菌的发酵与传统的微生物发
酵不同,基因工程菌带外源基因,发酵的目的
是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主
载体和克隆基因之间的相互关系还和环境
有关。
1、工程ห้องสมุดไป่ตู้培养的特点
工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模 为低。 为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施，提高重组 DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细 胞外分泌。 工程菌体的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或 维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生 某些抑制细胞生长的代谢物。在培养过程中应考虑控制培 养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生 长的代谢物，以保证细胞正常生长。
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
第八章 发酵工程在现代生物技 术中的应用
第一节 基因工程菌发酵
第一节 基因工程菌发酵
一、基因工程基本知识
基因工程(genetic engineering)的定义
基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种 或多种生物体(供体)的基因或基因组提取出来．或者人工 合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计，经过体外 加工重组，转移到另一种生物体(受体)的细胞内，使之能 在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。又称重组 DNA技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
衔接物连接法
cDNA链的合成
通过DNA聚合酶合成第二链
加入Sal I衔接物 S I核酸酶作用后的末端单链突出序列， 由Klenow补齐，加入第二衔接物Ecol I
双衔接物连接 法的基本程序
优点：可以实现定向克隆，防止发生 自连，同时对克隆片断的再删除也比 较方便。
在用DNA衔接物连接法时，如果待克
常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法
和接头连接法
用5’ 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断 在A和B分别中加入dATP和dTTP 末端转移酶
同聚物尾巴10~40个碱基
同聚物加尾法
同聚物加尾法或T4连接酶的平末 端连接法，无法用原来的限制酶作 特异性的切割，获得插入片断进行 进一步的研究。
衔接物连接法
环状
环状 环状
35- 45kb
≈300 kb
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列 PCYPAC1
100 - 2000 kb 100 - 2000 kb 〉 1000 kb
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 病毒载体 穿梭载体
基因有影响。
无机磷在许多代谢反应中是一个效应因
子，磷浓度不同，影响菌体生长。
（2）接种量的影响
接种量是指移入的种子液体积和培养液体 积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。
接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基 因表达。
接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入 对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会 抑制后期菌体的生长。
2、工艺要求
外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯
化。对发酵影响较大的几个因素有：
（1）培养基的影响
（2）接种量的影响
（3）温度的影响 （4）溶解氧的影响 （5）诱导时机的影响 （6）pH的影响
（1）培养基的影响
• 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要
保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。 • 常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、 果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、 酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵
鉴 定
（一）载体
• 载体（vector）是由在细胞中能够自主复 制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通 过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在 它的上面，而进行复制。
作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：
1、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效 的复制。 2、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一 种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 3、有适合的标记（抗药性基因），易于选择。
– 抗生素添加法 – 抗生素依赖变异法 – 营养缺陷型法
控制基因过量表达 控制培养条件（温度、pH、DO）
为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两
阶段培养法：
⑴先使菌体生长至一定密度；
⑵再诱导外源基因的表达。
由于第一阶段外源基因未表达，减小 了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别， 增加了质粒稳定性。
衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20 个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切 酶的酶切位点的回文结构。如：
BamH I 或Sau3A Hpa IICCGGATCCGG Hpa II
GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限 制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切 位点。
对同一工程菌控制不同的比生长数率可改 变质粒的拷贝数：
低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频 率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定 性；
高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频 率低但对稳定性不利。
3、质粒稳定性的分析方法
样品
不含抗性标记抗生素 10-12h 100个菌落 含抗性标记抗生素
平 板 培 养基
原核:包涵体,分泌型
真核:穿梭质粒
质粒(plasmid) 载体 粘粒(cosmid) λ噬菌体(λ phage)
细菌：氯化钙；电穿孔;
细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V
动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V 核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot. 蛋白鉴定：SDS-PAGE; HPLC; Western blot. 功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。
（6）pH的影响
pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有 影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对 pH进行适当的调节。 如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程 菌的生长条件，其最佳pH在6.8～7.4左右;培养 后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳pH 为6.0～6.5。
总之,最佳化的工艺是获得: 最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最 大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最 低失败率等。
其他条件：
分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体的种类和特征
受体细胞 质粒* 结构 环状 线状 环状 插入片断 〈 8* 9 - 24kb 〈 10 kb 举例 pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列 M13mp系列
等。还有无机盐、维生素等。
不同的碳源对菌体的生长和外源基因表 达有较大的影响。 使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼 吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较 大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。
葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对 lac启动子有利。
在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的
合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的
线性染色体
线性染色体 环状 环状
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
（二）载体DNA与外源基因片段的连接
1 、 黏 性 末 端 分 子 之 间 的 连 接 DNA
2、平末端DNA片断的连接
（1） T4DNA连接酶
（2） 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同
聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。
隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔
接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物
产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因
切断。
DNA接头（adapter）连接法： 1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系 的教授吴瑞 博士发明的。 它是一类人工合成的一头具有某种限制酶 粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核 苷酸短片断。 粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔 接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末 端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴 露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
2、质粒不稳定产生的原因 • 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； • 这两种菌比数率差异的大小。
（5）诱导时机的影响
对于λ PL启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感 型突变株（clts857），在28～30℃下培养时，该突变体 能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录；当温度升 高42℃时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目 的基因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升 温诱导表达。 在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109/个 为止，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养 和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。