光合细菌分离方法的优化研究摘要:以污水处理厂污泥中光合细菌为材料，对其进行了分离方法的优化。
采用半固体试管法、双层平板涂布法、平板稀释分离法、Hungate 滚管法、双层平板划线法对光合细菌进行了分离试验研究，比较各分离方法的优缺点。
关键词:光合细菌; 分离方法; 厌氧; 优化光合细菌( Photosynthetic bacteria，PSB) 广泛分布于淡水、海水、极地或温泉( 包括高热水体) 以及高盐、高有机质含量等不同的生态环境中，是一类进行不产氧光合作用、具有复杂代谢功能的微生物。
它能利用多种基质，可以异养、自养或兼性营养; 存在着好氧、厌氧和兼性厌氧类型［1］，具有较强的分解有机物特性，作为净化剂和饲料广泛应用于水产养殖和畜禽养殖［2 ～5］。
光合细菌属于水圈微生物中的一类，大部分 PSB 是从土壤、水沟和污泥中分离得到。
由于 PSB 在厌氧条件下更易生长，且分离技术要求高，很难富集并分离到活性高的光合细菌。
对光合细菌的多种分离方法进行比较，分析不同分离方法的效果。
1 实验材料和方法1. 1 样品来源光合细菌采自污水处理厂污泥，经富集培养，分离纯化，获得红假单胞菌属的光合细菌。
1. 2 培养基富集培养基: CH3COONa 3． 0 g; CH3CH2COONa0． 3 g; NaCl 1 g; ( NH4)2SO40． 3 g; MnSO425 mg; K2HPO40． 3 g; KH2PO40． 5 g; CaCl20． 05 g; MgSO4·7H2O 0． 2 g;FeSO4·7H2O 0． 005 g; 酵母膏 0． 1 g; 蛋白胨 0． 01 g; 蒸馏水1 000 ml; pH 7． 0［6］。
分离培养基: CH3COONa 3． 0 g; CH3CH2COONa0． 3 g; NaCl 0． 5 g; NH4Cl 1 g; MgSO4·7H2O 0． 2 g;K2HPO40． 3 g; KH2PO0． 5 g; CaCl20． 05g; MnCl2·4H2O0． 003 g; FeSO4·7H2O 0． 005 g; 酵母膏 0． 1 g; 蛋白胨0． 01 g; 谷氨酸 0． 0002 g; 蒸馏水 1 000 ml; 琼脂 20 g; pH 7． 2 ～ 7．4; 121 ℃ 高压灭菌 30 min。
R 培养基: CH3COONa 3． 0 g; NaHCO31． 0 g; NH4Cl1． 0 g; K2HPO40． 5 g; MgCl20． 2 g; FeCl2-EDTA 0． 005 g;NaCl 5． 0 g; 抗氧化剂 0． 25 g; 琼脂粉 8 g; 蒸馏水 1 000 ml，pH 7．4 ± 0．2; 121 ℃ ，灭菌 15 min。
1. 3 制备样品稀释度以无菌操作取25 ml 样品，放入装有225 ml 无菌水的灭菌三角瓶内，混匀。
用 10 ml 的灭菌移液管准确吸取10 ml的样品匀液放入装有 90 ml 稀释剂的三角瓶，混匀，制成1∶ 100 的样品液，依此类推，将菌液稀释至 10－ 6，10－ 7，10－ 8［7］1. 4 分离方法1. 4. 1 半固体试管法取光合细菌不同稀释度 0． 5 ml 或 1 ml 于试管，迅速倒入灭菌后的 R 培养基 20 ml( 温度为 50 ℃左右) ，待凝固后上层覆盖 5 ml 1% 灭菌纯琼脂。
同时用稀释剂做空白对照，于光照培养箱培养［8］。
1. 4. 2 双层平板涂布法取光合细菌不同稀释度 0． 5 ml 和 1 ml 菌液，在已经置备好无冷凝水的装有分离培养基平板上均匀涂布，同时上层覆盖分离培养基保持厌氧。
室温放置 1 h，用封口膜封口，30 ℃，1 500 ～2 000 lx 光照强度下厌氧培养［9］。
1. 4. 3 平板稀释分离法取光合细菌不同稀释度0． 5 ml 和1 ml 菌液与已熔化并冷却至 50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾人灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平*收稿日期:2011 －03 －07基金项目:辽宁省科技攻关项目( 2005229003) ; 辽宁省科技厅项目( 20060117-232) ; 辽宁大学“211”三期重点学科资助项目作者简介:徐成斌( 1980 － ) 男，汉族，辽宁省大连市人，讲师，主要从事环境微生物学研究。
E-mail: xuchengbin80@163． com通讯作者: 马溪平( 1957 － ) 女，汉族，辽宁省沈阳市人，教授，主要从事环境工程微生物学研究。
辽宁农业科学 2011 年板，同时上层覆盖一层分离培养基保持厌氧，保温培养一定时间即可出现菌落，用接种环将不同特征的单个菌落挑出，接种到相应的液体培养基中培养［7］。
1. 4. 4 Hungate 滚管法［10］固体培养基的滚管技术是指将装有热熔培养基的厌氧管放入装有冷水的平底盆中迅速不断转动而制成。
当琼脂围绕管壁完全凝固后，琼脂滚管即可垂直放置贮存，并可使少量未凝结的水分集中在底部。
用注射器将不同稀释度的菌液射入已滚好的厌氧管中培养，灭菌厌氧管接种时，橡皮塞在火焰上灼烧，稍冷后通过橡皮塞注入菌液，30 ℃，1 500 ～ 2 000 lx 光照强度下厌氧培养，待出现单菌落，接种到相应的液体培养基中培养。
1. 4. 5 双层平板划线法用灼烧后的接种环挑取一环细菌悬液，在已经制备好的装有分离培养基的平板上划线，之后用 15 ～20 ml 融化后冷却至50 ℃ 左右的培养基覆盖上层，静置待其凝固。
30 ℃，1 500 ～2 000 lx 光照强度下厌氧培养［7］。
2 结果与分析2. 1 深层试管法采用深层试管法见图 1 所示，在稀释度为 10－ 2、10－ 3、10－ 4、10－ 5时，细菌菌落密集，稀释度在 10－ 6～ 10－ 8时，较易形成单个菌落，采用破管法挑取菌落。
但此方法重复性不好，且由于培养基呈圆柱状，故为挑单个菌落造成困难。
图 1 深层试管法数码照片2. 2 双层平板涂布法与平板稀释分离法采用双层平板涂布法与平板稀释分离法，在稀释度10－ 2、10－ 4时，细菌菌落密集，稀释度在 10－ 5～ 10－ 7时，单菌落出现，但菌落特征不明显。
这种分离技术适合于好氧菌或兼性菌的分离［11］，应用到严格厌氧细菌的分离，分离效果相对较差，且使用双层平板涂布法不易形成单菌落。
2. 3 Hungate 滚管法Hungate 滚管技术已广泛的应用到厌氧微生物的分离上，本实验针对李永峰［12］改进的 Hungate 滚管技术进行调整，先将熔菌液化的固体培养基 4 ml 注入厌氧管中，在冷水中迅速的滚动，待固体培养基均匀的布满管壁，冷却，静止备用。
这可避免温度控制不当，培养基未注入菌液之前先凝固，从而避免培养基过高，导致注入的菌体死亡。
Hungate 滚管技术，如图 2 所示所用滚管透明度差，长出的菌落又面向管内生长，难以看清菌落的形态特征，给菌落的挑取造成一定的困难［13］。
图 2 Hungate 滚管法数码照片2. 4 双层平板划线法采用平板划线法见图 3 所示，观察菌落特征直观，菌落特征明显，采用灼烧的接种环透过上面一层培养基挑取位于中间层的单菌落。
这种分离方法较其他方法更易形成单菌落，且菌落挑取方法简单。
图 3 双层平板划线法数码照片·10·第 3 期徐成斌等: 光合细菌分离方法的优化研究2. 5 多种分离方法的比较表 1 光合细菌分离方法的比较方法深层试管法双层平板涂布法稀释倒平板法 Hungate 滚管法双层平板划线法优点较易形成单菌落，保持厌氧。
保持厌氧，挑菌方法容易，易于观察菌落的形态，分离速度快。
方法简便，挑菌方法容易，易于观察菌落的形态，更利于好氧菌的生长。
利于均匀冷却，菌落更易生长，且菌落生长速度快，保持厌氧。
易于观察菌落的形态，更容易出现单菌落以及易于单菌落的挑取。
缺点重复性差，挑菌落难度系数高。
不易形成单菌落。
不易形成单菌落，且菌落易成片生长。
透明度差，菌落挑取困难。
操作较复杂。
3 结论光合细菌在厌氧条件下更易生长。
为了快速、准确的分离得到光合细菌菌株，营造厌氧的条件必不可少。
通过上述试验得出如下结论:3. 1 使用深层试管法、Hungate 滚管法和双层平板画线法均能保持厌氧的条件。
深层试管法和 Hungate 滚管法分离，挑菌难度系数高; 双层平板涂布法和稀释平板法不易形成单菌落; 平板划线法易形成单菌落且单菌落更易挑取，但菌落分散效果不好。
3. 2 接种量是分离纯化光合细菌的重要环节，接种量大稀释倍数低产生的菌落密集，很难挑取单菌落，稀释倍数10－ 6～ 10－ 8为最佳，培养后有单菌落生成，易于分离。
3. 2 接种量确定后，双层平板化线法是一种快速可行的菌种分离方法。
参考文献:［1］ Holt J G，Krieg N R． Bergey＇S Manual of Systematic Bacteriolo- gy 9thed［M］． Baltimore London: Williams＆ Wilkins Co ，1994． 353 ～ 376．［2］沈镇昭．作物栽培学各论［M］．北京: 中国农业出版社，1994． 332 ～ 333．［3］张宪政．作物生理研究法［M］．北京: 农业出版社，1992．129 ～ 130．［4］李合生．植物生理生化实验原理和技术［M］．北京: 高等教育出版社，2000． 195 ～197．［5］刘金伟，沙伟，王艳军．低温胁迫对不同物候期细叶杜香的生理影响［J］．植物研究，2004 ，24 ( 2) : 197 ～200．［6］杨晨敏，谷军．哈尔滨市污染水质中光合细菌的分离、鉴定及发酵条件研究［J］．哈尔滨师范大学自然科学学报，1999，15( 6) : 95 ～ 98．［7］马放，任南琪，杨基先．污染控制微生物学实验［M］．哈尔滨: 哈尔滨工业大学出版社，2002． 49 ～50．［8］刘军义，汪文龙，李娟．光合细菌的计数方法———半固体试管法［J］．中国水产，2003，( 11) : 68 ～69．［9］孙军德，赵春燕，李炳学，等．光合细菌双层平板计数方法的研究［J］．沈阳农业大学学报，2001，32( 2) : 110 ～112．［10］ Hungate R E A． Roll Tube Method for Cultination of Strict Anaerobes［M］．北京: 高等教育出版社，1969，23．［11］穆军，张肇铭．一种分离纯化厌氧细菌的新方法———平皿夹层厌氧法［J］．山西大学学报，1998，21( 4) : 363 ～367．［12］李永峰，任南琪，李建政，等．发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术［J］．哈尔滨工业大学学报，2004，( 12) :50 ～ 54．［13］ Ueno Y，Otsuka． S，Mormoto M． Hydrogen production from in-dustrial wastewater by anaerobic microflora in chemostatculture［J］． Ferment，2002．The Research on Separation Optimization of Photosynthetic BacteriaXU Cheng-bin1，MENG Xue-lian2，MA Xi-ping1，ZHANG Li-hong1( 1． Environmental Science Institute of Liaoning University，Shenyang，Liaoning 110036; 2． Pharmacy Institute of Liaoning Uni-versity，Shenyang，Liaoning 110036)Abstract: Photosynthetic bacteria in the sewage sludge as the material，we study method of the separation op-timizing． We research semi-solid tube method，double plate coating method，dilution plate separation，Hun-gate roll tube method，double plate streaking method． Photosynthetic bacteria were isolated to compare the ad-vantages and disadvantages of each separation method．Key words: Photosynthetic bacteria; Separation; anaerobic; Optimization·11·。