犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒
VP2基因变异分析
犬瘟热(Canine Distemper,CD)是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。

犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)引起的以肠炎、腹泻与主的烈性传染病。

为了更好的控制与预防上述两种疫病的流行,本研究开展了犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析。

首先,本研究以CDV3的RNA为模板,原核表达纯化了带His标签的N蛋白截短片段(aa277-471),免疫BALB/c雌鼠后,将其B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过包被N蛋白截短片段(aa277-471)的ELISA筛选,获得分泌抗CDV的单克隆抗体杂交瘤阳性细胞1株,命名为1N8,亚类鉴定为Ig G1a,kappa链,该单克隆抗体间接免疫荧光检测阳性、WB检测阳性。

接下来采用噬菌体展示和肽扫描的方法,筛选1N8结合的抗原表位:合成N
蛋白(aa277-471)的15肽文库,每条多肽长度15aa,位移5aa,通过结合和筛选,得到一条与单克隆抗体1N8阳性反应的多肽,通过多肽N端和C端的不断缩减,最终证明该抗原表位的最小识别单位:351NFGRSYFDP359。

通过3D模拟,发现此表位位于N蛋白的外侧,其与CDV阳性血清具备一定的ELISA反应能力。

通过比对,其与CDV同属麻疹病毒、牛瘟病毒,小反刍兽疫病毒一致,并对小反刍兽疫病毒进行了WB验证,其结果为阳性。

以杂交瘤细胞1N8为模板,分离出抗体轻链和重链可变区,通过基因工程的方式组装成单链抗体,通过原核表达,获得了重组1N8单链抗体蛋白,经过间接ELISA和竞争ELISA方法检测,其具备1N8
单抗的部分活性。

以腺病毒为表达载体,研究了351NFGRSYFDP359表位疫苗的免疫效力:构建含351NFGRSYFDP359表位和肠炎细小病毒VP2基因的表达盒,通过PCR和WB检测,重组腺病毒在核酸和蛋白水平上均能表达出外源片段。

小鼠免疫试验显示:与商品化对照疫苗相比,重组腺病毒的CPV的ELISA效价与之相当,但CDV的ELISA 效价比较低。

最后,在本研究开展了CPV VP2基因遗传变异研究:历经4年,收集到我国主要城市的犬细小病毒阳性样品37份,分离病毒8株,获得犬细小病的阳性样品VP2基因序列22份,其中CPV-2a型20份,CPV-2b型2份,测序结果显示我国CPV 存在CPV-2a(Ser297Ala)变异,而且CPV VP2基因序列相似度为99.3-99.9%,系统发育树证明本次分离的大多数CPV毒株为一个大的分支中,与泰国KU143-09株类似,且不呈现地域相关性。