发酵食品工艺学实习
醋酸菌菌玲 马娇 孙盈盈 刘占明
实习背景
葡萄酒的变酸是由于醋酸杆菌进行发酵消 耗酒精而产酸造成的。而醋酸杆菌没有芽 孢，不能运动，兼有好氧型菌种和厌氧型 菌种，在液体培养基的表面容易形成菌膜。 在变酸的葡萄酒与氧接触时，容器壁会形 成一个可见的环。当我们将此环上的菌落 接种，进行增殖培养后，可以分离出产酸 菌。
参考文献：
周帼萍 醋酸菌筛选培养基的优化和优良醋酸菌分离的研究
稀释分离
培养基
平板分离培养基：酵母膏1%，葡萄糖1%，碳酸钙2% （165℃干热灭菌30min）,无水乙醇3%，琼脂1.8%，PH值 自然。
各取1mL的增值培养液，加入装有9mL的无菌生理盐水的试 管中，制成浓度梯度为10-1的菌悬液，然后逐步稀释到105，10-6，10-7，浓度梯度，吸取后三个浓度梯度的稀释液 各200uL，用涂布法接种于分离培养基平板上，每个浓度 梯度涂布2或3个平板，30℃恒温培养4天，重复上述操作， 直至平板出现单菌落。
左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培 养基中，30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。 参考文献： [10]基于固态培养基的醋酸菌扩大培养研究[j]_郇阿梅
定性定量
1.菌株形态特征: 镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成对、成链
排列,个体大小为（0.5～0.7)μm ×(1.0~1.5)μm。 2.培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基
富集培养
培养基 增值培养基：酵母膏1%，葡萄糖1%，0.02%的结晶紫0.5%，制霉素
5mg/mL,PH5.5,0.1Mpa灭菌30min,待冷却到70℃是时加3%（V/V）的无 水乙醇。 富集培养：在无菌条件下，吸取10mL的葡萄酒样，加入90mL增值培 养基中，25-30℃恒温培养4小时。
参考文献
[1]醋酸菌的分离与鉴定以及红茶菌培养的研究[j]_王硕 [2]醋酸菌菌种的冷冻干燥保藏研究[j]_邵伟 [3]醋酸菌筛选培养基的优化和优良醋酸菌分离的研究[j]_周帼萍 [4]醋酸菌优良菌株的筛选及培养基优化[j]_姜晓芝 [5]醋酸菌与其发酵的机理_[j]包启安 [6]高产醋酸菌的筛选及其形态生化特征研究[j]_张忠明 [7]果醋酿造用优良菌种的选育及果醋饮料的研制[j]_侯爱香 [8]河溪香醋优势醋酸菌筛选[j]_黄群 [9]黑加仑果醋优良菌种筛选及其发酵工艺研究[j]严宝冬 [10]基于固态培养基的醋酸菌扩大培养研究[j]_郇阿梅 [11]葡萄酒中醋酸菌的生长存活与氧浓度的关系[j]_于清琴 [12]宋河大曲中醋酸菌的分离鉴定及产酸特性[j]_侯小歌
实习内容
1.对实验原料样品进行预处理，使其酸败，致使样品菌繁 殖
2.将样品菌种扩大培养。将样品加入无菌试管，装入无菌 水，振荡均匀后进行梯度稀释，取各梯度的样品稀释液分 别涂布于溴甲酚紫显色平板，涂布完成后30℃倒置培养 48h左右。
3.根据菌落不同形态进行纯化接种。选取菌落数在30-50个 左右的平板，挑取该平板上的所有菌落转入常规基础培养 基
4.对纯化后的菌株进行产酸定性实验。 5.对产酸菌株进行产酸能力定量实验。
样品
实验流程
富集培 养培养
稀释分 离
纯化
斜面保 藏
定性定 量
菌种保 藏
样品准备
葡萄酒 1.买来新鲜葡萄酒，测定其PH值。选择葡萄酒时，酒精浓度要低。（醋酸菌
能够将酒精氧化生成乙酸。因此，乙醇是醋酸菌一个很好的碳源，但当酒精 浓度很高时就会抑制醋酸菌的生长。De Ley et al. (1984)指出，培养基中 含有5％乙醇，检测到只有58％醋杆菌生长；当培养基中乙醇为13％时，醋酸 菌含量会减少到13％。其中，只有20％巴士醋杆菌，没有纹膜醋杆菌。只有5 ％的葡糖杆菌属能够在含有5％乙醇的培养基上生长。但是，周所周知，醋酸 菌在乙醇含量为10-14％（v/v）的培养基上仍够能存活甚至生长。Vaughn (1955)指出醋酸菌能够忍耐的最大酒精浓度是14％和15％（v/v） 2.将买来的葡萄酒敞口置于室温下。（醋酸菌在完全通气的葡萄酒中生长的 数量达108cfulml,而在溶解氧含量较低时，它们的生长能力较弱。根据Holt et al. (1994)，醋杆菌和葡糖杆菌的最适生长温度是25-30℃，在37℃就观 察不到葡糖醋杆菌的生长。De Ory et al.（1998) 发现纹膜醋杆菌生长所能 忍受的最高温度是35℃。） 3.过一段时间测定葡萄酒的PH,若PH值下降，说明有醋酸菌产生。当PH值达到 5.5-6.3时，就可以进行下一步实验。（醋酸菌在完全通气的葡萄酒中生长, 产生大量的醋酸1.28-3.75g/L使其PH 下降。醋酸菌生长的最适pH是5.56.3(Holt et al., 1994)。） 参考文献： 梁曼 葡萄酒与醋酸菌 于清琴 葡萄酒中醋酸菌的生长存活与氧浓度的关系
上生长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整 齐,培养2 d能产酸,使CaCO3溶解形成透明圈,继续培养将 乙酸氧化分解产生CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。 在斜面培养基上生长良好,培养2 d后呈油脂状,并产酸。 在10% ( v / v)乙醇的培养基上、Hoyer2Frateur培养液 中、30%葡萄糖培养基上均不生长。
参考文献 ：醋酸菌筛选培养基的优化和优良醋酸菌分离的 研究[j]_周帼萍
纯化
培养基 分离纯化平板培养基：酵母膏1g，葡萄糖1g，碳酸钙2g,
琼脂2g,水100mL,121℃灭菌20min，冷却至70℃加入4mL无 水乙醇和0.5mL0.02%结晶紫冰醋酸溶液。 挑取平板分离培养基中菌落长势良好，菌落分布均匀，透 明圈大而清晰且个数适中的一个平板中的单菌落，进行纯 化。 参考文献： 高产醋酸菌的筛选及其形态生化特征研究[j]_张忠明
斜面保藏
培养基 1.斜面培养基 1%酵母膏，1%葡萄糖，CaCO31.5%,,琼脂2%，pH5.5，分装
试管，加入95%无水乙醇4%(v/v) 2.斜面保藏培养基 1%酵母膏，1%葡萄糖，CaCO31%,,琼脂2%，pH4.5，分装试
管，加入95%无水乙醇2%(v/v) 培养基要在121℃灭菌20min备用，选取菌落数在30~50个