您的位置:在线学习->第十一章抗生素类药物分析(1)第十一章抗生素类药物分析基本要求学习要点内容第一节概述一、特点:化学纯度较低, 同系物多,异构体多,降解物多,稳定性差。
二、鉴别方法:生物学法,理化方法。
三、特殊检查项目:异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌,组分分析,聚合物等。
四、含量测定或效价测定(一)、微生物学法——通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效价。
其原理恰好与临床应用要求一致,更能确定抗生素的医疗价值。
1、对于分子结构复杂、多组分的抗生素,生物学法是首选的效价测定方法。
2、本法的优点:灵敏、用量小,结果直观适用范围广:纯度好的、差的制品,已知或新发现的抗生素均适用,同一类型的抗生素不需分离,可一次测定其总效价。
3、缺点:操作步骤多,测定时间长,误差大等。
(二)、理化方法——适用于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素。
1、本法的优点:迅速、准确、有较高的专属性。
2、缺点:对含有具同样官能团杂质的供试品不适用,或需采取适当方法加以校正。
而且当该法是利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应时,所测得的结果,往往只能代表药物的总的含量,并不一定能代表抗生素的生物效价。
第二节β-内酰胺类抗生素一、化学结构与性质(一)、青霉素族(二)、头孢菌素族二、鉴别试验(一)、呈色反应1、羟肟酸铁反应青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用,β-内酰胺环破裂生成羟肟酸;在稀酸中与高铁离子呈色。
2、茚三酮反应3、与重氮苯磺酸的偶合反应4、硫酸-甲醛试验第1页/共8页您的位置:在线学习->第十一章抗生素类药物分析(2)(二)、各种盐的反应1、钾、钠离子的火焰反应2、有机胺盐的特殊反应(如普鲁卡因青霉素的重氮化-偶合反应)(三)、色谱法1、高效液相色谱法(HPLC)2、薄层色谱法(TLC)3、中国药典收载的头孢菌素族药物和大多数青霉素族药物采用HPLC法进行鉴别。
(四)、光谱法1、IR——各国药典对收载的β-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。
2、该类抗生素共有的特征峰:1)、β-内酰胺环羰基的伸缩振动(1750~1800)2)、仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动(3300cm-1±,1525 cm-1±,1680 cm-1±)3)、羧酸离子的伸缩振动(1600 cm-1±、1410 cm-1±)3、UV——利用最大吸收波长鉴定法或利用水解产物的最大吸收波长鉴定法。
三、特殊杂质的检查本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物,有关物质,异构体等,一般采用HPLC法控制其量,也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。
(一)、聚合物——HPLC法1、色谱条件与系统适用性试验用葡聚糖凝胶G-10(40~120?m)为填充剂,玻璃柱内径1.3~1.5cm,床体积50~60mL;流动相A为含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠 2.19g和磷酸二氢钠0.54g,加水1000mL使溶解,调节pH值至7.0),流动相B为0.01%十二烷基硫酸钠溶液;流速为每分钟1mL;检测波长为254nm。
以流动相A为流动相,用1mg/mL蓝色葡聚糖2000溶液进样200?L进行测定,理论板数应不低于900,拖尾因子在0.75~1.5,对照品溶液以流动相B为流动相,重复进样200?L,峰面积值的相对标准差应小于 5.0%。
2、对照品溶液的制备取头孢他啶对照品适量,精密称定,加水制成含头孢他啶100ug/1mL的溶液,摇匀。
3、测定法取本品适量,精密称定,加水制成含头孢他啶20mg/1mL的溶液,立即进样200uL,以流动相A为流动相进行测定,记录色谱图;另取对照品溶液200uL注入液相色谱仪,以流动相B为流动相,记录色谱图,按外标法计算,本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%。
4、自身对照外标法的原理:1)、该法是利用特定条件下β-内酰胺类抗生素可以缔合成与高分子杂质有相似色谱行为的缔合物,即在Kav=0处表现为单一的色谱峰。
2)、以药物自身为对照品,测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标;3)、然后改变色谱条件,测定样品,记录样品色谱图中Kav=0处的高分子杂质峰的响应指标,4)、按外标法计算,即得样品中高分子杂质相当于药品本身的相对含量。
第2页/共8页您的位置:在线学习->第十一章抗生素类药物分析(3)(二)、有关物质和异构体1、例 1 头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查:>>色谱条件与系统适用性试验:要求头孢呋辛酯A,B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯△2-异构体之间的分离度R﹥1.5;理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算,n ≥1500。
>>异构体——照含量测定项下方法试验。
以A异构体峰的相对tR为1.0,B异构体峰的相对tR约为0.85,>>供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.48~0.55。
>>有关物质——按自身对照法测定有关物质限量2、△2-异构体是取头孢呋辛酯对照品经加热破坏处理而制得的,其相对tR约为 1.2 。
(三)、吸收度1、如青霉素钠(钾)的吸收度检查:>>取本品,加水制成每1mL中含1.80mg的溶液,照分光光度法,在280nm的波长处测定吸收度,不得大于0.10;在264nm的波长处有最大吸收,吸收度应为0.80~0.88。
>>此法中264nm 处吸收值用来控制青霉素钠(钾)的含量,280nm处吸收值用来控制杂质的量。
2、头孢氨苄中有关物质的检查——反相TLC法四、含量测定(一)、高效液相色谱法1、这是β-内酰胺类抗生素含量测定的主要方法。
中国药典收载的本类抗生素原料及制剂共约70种,应用HPLC法测定含量的有50多种,约占78%。
2、本类药物的HPLC法通常采用反相HPLC,以外标法计算含量。
(二)、碘量法1、利用青霉素或头孢菌素分子不消耗碘,而其降解产物消耗碘,采用剩余碘量法测定,以标准对照法计算含量。
反应分两步:第一步:青霉素在碱性条件下水解,该步反应是按化学计量进行的。
第二步:水解生成的青霉噻唑酸在酸性条件下与定量过量的碘作用,剩余的碘用硫代硫酸钠滴定。
同时做空白试验。
并用青霉素标准品进行平行对照测定第一步第二步第3页/共8页您的位置:在线学习->第十一章抗生素类药物分析(4)2、讨论:>>温度(24-26℃ )。
>>pH(4.5)。
>>时间(15~ 20min)等影响反应,耗碘量没有固定的当量关系。
>>采用青霉素标准品平行对照测定,以抵消上述可变因素的影响。
>>青霉素的降解产物等杂质亦可消耗碘而影响测定结果,所以用未经水解的样品液作空白试验校正。
式中:S0、R0分别为滴定供试品空白液和对照品空白液消耗的硫代硫酸钠溶液的体积(mL);C为对照品浓度(g/mL);U、U0分别为对照品的效价(单位/毫克)和样品的标示量;W、D分别为供试品取样量(g)和稀释倍数。
(三)、电位络合滴定法1、青霉素分子不与汞盐反应,而其碱性水解产物如青霉噻唑酸在一定条件下能与二价过渡金属离子如Cu2+、Hg2+形成稳定的络合物,可用硝酸汞标准液滴定,电位法指示终点(滴定中出现两个突跃,以第2个突跃为终点,反应摩尔比为1:1 )2、由于样品中存在的降解杂质也会消耗硝酸汞,为消除干扰,采用两次滴定法:3、水解后滴定——总量%4、直接滴定——降解杂质量%5、样品含量% =总量% —降解杂质量%6、讨论:(1)、水解必须完全。
溶液的pH值和反应时间直接影响水解的完全程度,水解如不完全,将使测定结果偏低。
(2)、本法空白实验的作法与碘量法类似,即空白实验时也要称取供试品,但不经氢氧化钠水解。
空白实验的目的也是为了消除供试品中可能存在的降解产物的干扰。
(3)、与碘量法比较,汞量法测定青霉素的主要优点是不需要青霉素标准品作对照,汞盐滴定液用EDTA标定即可。
(四)、硫醇汞盐法1、青霉素族抗生素在咪唑的催化下与氯化高汞定量地反应生成相应的青霉烯酸硫醇汞盐,在324~345nm波长范围内有最大吸收。
第三节氨基糖苷类抗生素这类抗生素的化学结构都是以碱性环已多元醇为苷元,与氨基缩合而成的苷,故称为氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides antibiotics)主要有链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龙霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。
一、化学结构与性质(一)、链霉素第4页/共8页您的位置:在线学习->第十一章抗生素类药物分析(5)(二)、巴龙霉素(三)、庆大霉素庆大霉素R1R2R3分子式C1CH3CH3H C21H43N5O7C2CH3H H C20H41N5O7C1a H H H C19H29N5O7C2a H H CH3C20H41N5O7二、鉴别试验(一)、茚三酮反应——本类抗生素具羟基胺和α-氨基酸的性质,可与茚三酮缩合成蓝紫色化合物。
(二)、N-甲基葡萄糖胺反应——水解,产生葡萄糖胺衍生物,在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物,再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应,生成樱桃红色缩合物。
(三)、麦芽酚(Maltol)反应——在碱性溶液中,链霉糖经分子重排、扩环、消除反应,生成麦芽酚,与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。
第5页/共8页您的位置:在线学习->第十一章抗生素类药物分析(6)(四)、坂口(Sakaguchi)反应——链霉素水溶液加氢氧化钠试液,水解生成链霉胍与8-羟基喹啉、次溴酸钠反应,生成橙红色化合物。
三、特殊杂质检查及组分分析(一)、链霉素中链霉素B的检查1、链霉素B是指甘露糖链霉素,由发酵产生, 其生物活性仅为链霉素的20%~25%,能被甘露糖链霉素B苷酶水解成甘露糖和链霉素。
2、现行各国药典中,仅BP(2000)规定了该项检查,采用薄层色谱法检查。
(二)、硫酸奈替米星中有关物质的TLC检查:1、供试品溶液:150mg / mL;2、标准品溶液(1) 1.5mg / mL;3、标准品溶液(2) 3mg / mL;4、标准品溶液(3) 1.44mg西索米星/mL,5、点样:各2uL,6、展开剂:二氯甲烷-甲醇-浓氨溶液(4:4:2)7、显色:0.2%茚三酮溶液,110℃加热20min。
8、结果:供试品溶液如显杂质斑点,其颜色(1)、与标准品溶液(3)所显主斑点相比较,不得更深(1%),(2)、其他杂质与标准品溶液(1)所显主斑点相比较,均不得更深(1%),(3)、如有一点超过,应不深于标准品溶液(2)的主斑点(2%)。